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群体感应(Quorum-sensing,QS)系统是细菌间利用信号分子进行交流的一种方式。水产品腐败主要由微生物活动引起,N-乙酰基高丝氨酸内酯(N-Acylated Homoserine Lactones,AHLs)等信号分子介导的群体感应(QS)作为微生物重要的生理调控系统成为生命科学研究热点之一,但研究多集中在病原菌致病因子的调控方面,对腐败菌的QS调控机制及其在水产品腐败中的作用仍不明晰。鉴于此,本文以大菱鲆为研究对象,在冷藏过程中分离鉴定其腐败菌-温和气单胞菌,研究其信号分子分泌动力学及环境因素对AHLs分泌情况的影响,同时,研究了 AHLs对温和气单胞菌体内外致腐能力的影响,旨在深层次揭示微生物引起的鱼类腐败机制,为开发靶向控制腐败菌QS系统的水产品保鲜新技术提供理论依据。主要研究结论如下:1.利用选择性培养基对4℃冷藏大菱鲆腐败菌分离纯化并得到单菌落,结合VITEK-2全自动微生物鉴定仪以及16S rRNA测序鉴定并构建菌株系统发育树,同时利用生物传感菌CV026和A136对该菌的群体感应现象进行初步检测,结果显示,准确鉴定一株腐败菌为温和气单胞菌(Aeromonas sobria AS7),该菌可以使CV026产生紫色素和A136分解X-gal产生蓝色反应,说明菌株AS7产生的信号分子既有短链的AHLs又有长链或是酰基侧链C-3有羰基取代的AHLs。2.建立了气相色谱-质谱技术(GC-MS)结合信号分子标准品定性定量分析菌液中信号分子的种类和含量的方法。结果表明,菌株AS7菌液中检测到至少5种AHLs,分别是C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL 和 C12-HSL,其中以蔗糖为碳源时,C8-HSL 和 C10-HSL为主要的信号分子,浓度分别为144.7和515.9 μg/L,C4-HSL、C6-HSL和C12-HSL浓度很低,分别为2.1、5.2和3.4 μg/L。3.利用(GC-MS)定量研究了环境条件(NaCl浓度、温度、碳源、pH)以及培养时间对菌株AS7信号分子分泌的影响,结果表明,不同条件下产生的AHLs种类和含量明显不同,在32 h时AHLs分泌总量达到峰值,为514.4 μg/L,其中,C4-HSL和C6-HSL为主要的信号分子,C10-HSL在培养到20 h以后消失;pH=8时,AHLs分泌总量最大,达到582.6 μg/L,其主要的信号分子为C8-HSL和C10-HSL,在pH=9时明显降低,碱性环境下信号分子不稳定容易开环降解从而失去信号分子作用;盐浓度为0.7%时,AHLs分泌总量达到最大值,为595.3μg/L,C8-HSL和C10-HSL为主要信号分子,4%盐浓度下C4-HSL和C6-HSL信号分子消失;菌株AS7利用碳源分泌AHLs的能力大小为:蔗糖>麦芽糖>葡萄糖>乳糖>果糖>木糖,木糖为碳源时,信号分子分泌量达到最低值,为221.1 μg/L,同时,蔗糖、葡萄糖和麦芽糖为碳源时,信号分子分泌量达到峰值,分别为671.4、623.3和598.7 μg/L;C8-HSL和C10-HSL为优势信号分子;在低温环境4和10℃,菌株AS7具有较强的AHLs分泌能力,在25和28℃都表现出较强的信号分子分泌能力,而37℃下信号分子分泌量急剧下降,C8-HSL和C10-HSL为菌株AS7主要的信号分子,在25和28℃,AHLs的分泌量达到峰值,分别为582.6和585.2μg/L。4和10℃时,菌株也能分泌AHLs并达到较高水平,但在低温条件下,并未检出C4-HSL和C6-HSL。4.研究了不同处理(营养基质、共生培养和添加不同种类的AHLs)对温和气单胞菌的致腐因子(嗜铁素、胞外蛋白酶、生物被膜)产生情况的影响,结果表明,菌株AS7嗜铁素的分泌受到培养基质的影响,在脱脂牛奶等天然基质中可以大量分泌嗜铁素,而市售的合成培养基中不能分泌嗜铁素;AHLs的添加对嗜铁素的产生量有影响,其中,C8-HSL影响显著,随添加的增加,嗜铁素分泌量呈现正相关(P<0.05),而C6-HSL影响不显著(P>0.05);共生条件下,温和气单胞菌对荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌嗜铁素的分泌有明显促进作用;AHLs的添加可以促进温和气单胞菌胞外蛋白酶和生物被膜的产量,且呈现正相关(P<0.05),说明AHLs对温和气单胞菌产生胞外蛋白酶、嗜铁素和生物被膜具有调控作用。5.通过测定接种菌株AS7的大菱鲆无菌鱼块在4℃冷藏过程中其新鲜度指标(pH、TVB-N、持水性、K值、菌落总数)的变化,对比添加不同种类的AHLs信号分子标准品,来研究群体感应对温和气单胞菌体内致腐能力的调控作用,结果表明,添加C6-HSL对该菌的致腐能力没有显著影响(P>0.05),而C4-HSL和C8-HSL分别在不同的新鲜度指标中表现出明显的相关性,其中TVB-N值有显著影响(P<0.01),说明群体感应可以通过AHLs来调控该菌致腐能力。