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特异性蛋白（Specificity protein，Sp）家族是一类重要的转录因子，属于特殊转录因子，广泛参与细胞内的转录调控。目前该家族有Sp1-Sp9等9个成员，Sp3作为家族成员之一，其转录调控作用具有特殊性，在不同肿瘤及肿瘤不同时期中Sp3可表现出激活或抑制转录的双重作用，然而在原发性肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）中关于Sp3的研究甚少。本课题组前期研究提示Sp3可能作为一个促癌因子存在并且促进肝癌的发展，但其分子机制有待进一步研究证实。β-catenin是Wnt信号通路中的关键作用分子，不仅在钙粘蛋白介导的细胞黏附、细胞分化及细胞骨架中起重要作用，而且能够在Wnt信号传导通道的关键环节调控Cyclin D1及C-myc等原癌基因的表达。Sp家族与Wnt/β-catenin信号通路存在一定的联系。本课题组前期对HCC组织与肝癌细胞株HepG2中β-catenin的检测发现β-catenin存在过表达，在HepG2中运用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术沉默Sp3后，β-catenin的表达随之减少，提示在肝细胞癌中Sp3可能与β-catenin存在相互作用，直接或间接调控β-catenin的表达，机制尚未清楚，需要进一步研究证实。第一部分RNAi沉默Sp3后肝癌基因表达谱的研究目的：分析转录因子Sp3沉默后人肝癌细胞株HepG2的基因表达谱变化，探讨在肝癌中转录因子Sp3调控的下游基因及信号通路，同时初步确定Sp3与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法：采用RNAi技术沉默人肝癌细胞株HepG2中Sp3表达，人全基因组表达谱芯片筛查Sp3沉默后的差异表达基因，实时荧光定量PCR（real-timequantitative PCR，qRT-PCR）验证部分细胞周期相关的差异表达基因，流式细胞术检测细胞周期。结果：HepG2细胞中Sp3表达下调后，筛查出差异表达基因1789个，其中上调基因1007个，下调基因782个，涉及细胞增殖、分化、凋亡、黏附、代谢等多方面功能。同时，Wnt/β-catenin信号通路受Sp3下调影响，β-catenin等多个成员的表达水平随之下调。qRT-PCR结果显示Sp3表达下调后，CCND1，CCNE2，TGFB1mRNA表达下调，CDKN2A mRNA表达上调，与基因芯片结果一致。流式细胞术结果显示Sp3表达下调后G1期细胞明显增多。结论：Sp3表达下调后人肝癌细胞株HepG2的基因表达谱发生明显变化，并出现G0/G1期阻滞，Sp3可能通过细胞周期因子以及Wnt/β-catenin信号通路参与HCC的发生发展过程。第二部分转录因子Sp3对人β-catenin的转录调控作用目的：研究转录因子Sp3对人β-catenin启动子转录调控作用，探讨Sp3与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法：Sp1，Sp3转录因子表达质粒单独以及共同与β-catenin启动子（-410/-1bp）报告基因质粒瞬时转染HEK293T细胞，通过双荧光素酶报告基因实验检测报告基因β-catenin的相对活性。结果：Sp1表达质粒在0.4μg剂量时能提高启动子的活性2.4倍，Sp3表达质粒在0.4μg剂量时能显著提高启动子的活性5.3倍；0.4μg总量的Sp1与Sp3表达质粒共转染293T细胞，随着Sp3/Sp1比例的递增，β-catenin启动子转录活性无明显变化；共同转染Sp10.3μg与Sp30.1μg时，启动子活性提高3.5倍，比单独转染的转录活性强。结论：Sp3能促进β-catenin基因启动子（-410/-1bp）的转录，Sp1的转录激活作用则较弱，Sp3/Sp1比例的变化对该启动子的转录活性无明显影响，Sp1，Sp3可能存在协同作用，Sp3可能通过调控β-catenin的表达影响Wnt/β-catenin信号通路。