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尽管骨科近年来发展迅速,但骨折不愈合仍是临床中面临的一个重要问题,在正常的骨折愈合过程中,未分化的骨髓间充质干细胞在骨形态蛋白(BMPs)和调节因子的影响下增值,分化成软骨细胞和骨细胞,最终形成骨,达到修复损伤。然而一部分骨折没有由于没有完成修复过程,最终导致延迟愈合或者不愈合,增加手术次数,延长住院时间。骨折不愈合的诊断是建立在一系列临床症状和物理检查上的,它包括疼痛,骨折端的活动以及放射学检查。骨折治疗6-8个月后仍没有愈合考虑骨折不愈合,不同部位的发病率约5%-20%。
近年来随着干细胞培养、分离等技术的发展使骨折不愈合的治疗有了更多的选择。从骨髓提取分离、纯化间充质干细胞(mesenehymalstemcells,MSCs)能演变为多种组织细胞,在多种因素的刺激下可分化为几乎各种中胚层细胞,如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等,可作为各种组织修复的选择。本实验即以同种异体兔骨髓间充质干细胞修复兔骨折不愈合模型,观察其修复兔桡骨骨折不愈合模型的效果,从而探讨同种异体MSCs的体内修复骨折不愈合的机制,为进一步使用同种异体MSCs治疗骨折不愈合提供实验支持。
目的:
研究兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、纯化方法,以及观察兔骨髓间充质干细胞生长情况。用兔桡骨制作骨折不愈合的模型。通过骨髓间充质干细胞的培养扩增,治疗兔桡骨骨折不愈合模型,研究骨髓间充质干细胞移植治疗骨折不愈合的效果及机制,以及不同数量的细胞移植对骨折不愈合的影响。从而进一步为人自体、异体骨髓间充干细胞的体外培养应用治疗骨折不愈合提供依据。
方法:
1、用Brownlow法制做新西兰大白兔桡骨骨折不愈合模型,将其一侧桡骨干中远1/3截断,去除5mm骨质及骨膜,用骨蜡封闭骨折端,使骨折保持5mm的间隙。术后8周,使其形成兔桡骨萎缩性骨折不愈合的模型。
2、采用贴壁筛选法从兔股骨近端髓腔骨髓组织中分离、纯化BMSCs,进行体外培养扩增,应用免疫组化染色方法对细胞表型、纯度进行鉴定。
3、将培养的细胞低温保存,待骨折不愈合模型完成后,复苏MSCs,扩增培养,消化培养瓶中的细胞,PBS洗涤后,计数,制成细胞浓度为1×106/ml的细胞悬液,将骨折不愈合模型随机分为3组,A组给予不愈合部位0.2ml细胞悬液注射。B组给予不愈合部位0.4ml细胞悬液注射。C组不愈合部位仅打通髓腔。分别在给予MSCs移植治疗4周和8周行X线检查,观察骨折愈合情况。
结果:
1、骨折不愈合模型制作术后8周,影像学和组织学检查,其形成类似于临床萎缩性骨折不愈合的模型。
2、培养的兔骨髓间充质干细胞贴壁生长,细胞多为为短梭形或纺锤形,典型的为漩涡状排列,比较均一;采用免疫细胞化学检查发现培养的细胞表达细胞表面抗原CD44,不表达CD34,证实所培养的细胞为兔BMSCs。
3、BMSCs移植治疗骨折不愈合术后8周行X线检查和组织学显示:A组中7只兔桡骨骨折愈合,3只未愈合;B组中9只兔桡骨骨折愈合,1只未愈合;C组中有2只兔桡骨骨折愈合,8只未愈合。干细胞治疗组较对照组骨折愈合率高,p<0.05,差异具有显著性。
结论:
1、通过贴壁筛选法可分离、纯化骨髓间充质干细胞,经过体外培养扩增可获得成分较均一的BMSCs。该方法简便有效,分离、纯化效果较理想,为细胞移植治疗提供良好的来源。
2、同种异体骨髓间充质干细胞可以成功治疗兔桡骨骨折不愈合的模型,并且随着移植细胞数量的增加骨折愈合率增加。