目的:探讨血管性痴呆(vascular dementia,VD)的病机和治法;探索VD发生发展过程中神经再生的“肾精亏虚”病机生物学基础,分析“加减薯蓣丸”(补肾生髓益智法)对VD发生发展的防治效应及作用机制。方法:1理论研究:查阅相关文献,从中医基础理论“肾藏精”理论入手,结合现代中医辨治VD的研究进展,探讨VD的基本病机和治法;溯源“加减薯蓣丸”,结合前期研究成果分析“加减薯蓣丸”对VD的作用机理。2实验研究:120只SPF级健康成年Wistar雄性大鼠适应性饲养1周后按随机数字法分为4组:(1)正常对照组(下称正常组):Wistar雄性大鼠20只,不予手术,在造模后第三天开始,予灌胃生理盐水10ml/kg/d×8周。(2)假手术组:Wistar雄性大鼠20只,予颈部局部皮肤切开,并分离出颈总动脉后,既不结扎也不剪断,暴露5分钟直接缝合皮肤。造模后第三天开始,予灌胃生理盐水10ml/kg/d×8周。(3)VD模型组(下称模型组):造模(改良2-VO法)后进行行为学筛查,将符合VD表现的大鼠随机均分为两组(模型组和加减薯蓣丸组),造模后第三天开始,予灌胃生理盐水10ml/kg/d×8周。(4)加减薯蓣丸组(下称治疗组):分组方法同模型组,造模后第三天开始,予灌胃加减薯蓣丸10ml/kg/d×8周。记录大鼠一般状态;分别统计不同时间节点大鼠死亡数,计算大鼠存活率,Log-rank法统计大鼠生存曲线;用Morris水迷宫大鼠进行行为学检测;HE染色光镜下观察大鼠海马病理切片;TUNEL荧光染色后光镜下观察大鼠海马细胞凋亡的情况;采用免疫组织化学方法观察ERK5/BMK1上游信号因子(MEKK2、MEKK3、mek5)及erk5的表达;运用westernblot法检测mekk2、mekk3、mek5、erk5蛋白表达。结果:1理论探讨:“肾精亏虚”是vd的基本病机:肾精亏虚是vd的发生根本。肾精亏虚可生痰、瘀,痰、瘀反过来又使肾虚更甚,最终形成“虚虚实实”的恶性循环。肾虚、痰瘀互相影响,互为因果,既是vd发生的前提,亦为vd发展变化的内在动力。所以,在辨治vd时,虽说“肾精亏虚”是vd的基础,亦当重视补肾填精益智与健脾化痰通窍、养血活血通络并举以攻顽疴。对vd的治疗可从补肾立法:通过中医“补肾”法治疗vd的肯定疗效,结合采用现代医学技术进行研究的国内外相关研究成果,提示脑的功能与肾密切相关,且脑的虚性病变常治以“补肾”。加减薯蓣丸治疗vd的机理分析:加减薯蓣丸是由《金匮要略》中的“薯蓣丸”化裁而来,具有“补肾生髓益智”功效;导师研究团队在前期研究中发现,加减薯蓣丸在干预认知障碍方面取得了很好的临床疗效,并且从行为学、病理学及分子生物学等方面一定程度的揭示了vd发生发展的病理机制及过程。2实验结果2.1各组大鼠一般状态:正常组:整个实验过程毛发、口唇、指甲、眼珠、精神及食欲等一般情况良好。模型组:造模前,实验大鼠毛发、口唇、指甲、眼珠、精神及食欲等一般情况良好。造模后,出现不同程度的毛色枯暗、唇甲紫暗、精神萎靡而活动变少、睡眠增多而食欲下降;部分大鼠出现不同程度的眼睑下垂、眼裂减小及眼球轻度凹陷;个别老鼠出现腹部逐渐胀满如球状,伴明显的进食和排便减少,毛色粗糙无光泽,四肢逐渐消瘦而死亡等。经过一段时间喂养或药物灌胃后,一般情况较造模后有所改善。与正常组和假手术组比较,一般情况差。假手术组:术前,实验大鼠毛发、口唇、指甲、眼珠、精神及食欲等一般情况良好。术后3天内出现程度不等的毛色枯暗、精神萎靡而活动变少,其余一般情况良好。随着正常饲养,一般情况基本恢复。与正常组比较差异不明显。治疗组:造模前,实验大鼠毛发、口唇、指甲、眼珠、精神及食欲等一般情况良好。造模后,出现不同程度的毛色枯暗、唇甲紫暗、精神萎靡而活动变少、睡眠增多而食欲下降;部分大鼠出现不同程度的眼睑下垂、眼裂减小及眼球轻度凹陷;个别老鼠出现腹部逐渐胀满如球状,伴明显的进食和排便减少,毛色粗糙无光泽,四肢逐渐消瘦而死亡等。经过一段时间喂养或药物灌胃后,一般情况较造模后有所改善。与假手术组比较,一般情况不良;与模型组比较,一般情况良。2.2各组大鼠存活情况:各组动物存活情况进行log-rank(mantel-cox)检测,p<0.05,存在统计学意义。结果详见图1。接受模型构建的大鼠在造模后7天(灌胃前),存活率为87.1%。从生存曲线来看,模型组大鼠在造模术后7天(灌胃前)、造模后灌胃2周和灌胃4周的存活率分别为94.44%、85.86%和85.86%;假手术组上述各存活率维持在96.00%;治疗组上述各存活率分别为95.96%、89.96%和77.11%。2.3morris水迷宫检测结果:定位航行实验结果显示:不同时间点逃避潜伏期比较,造模后7天(灌胃前),模型组(116.47±6.99)和治疗组(116.89±5.44)的平均逃避潜伏期均高于假手术组(94.85±13.47);造模后灌胃4周,治疗组(89.92±3.20)低于模型组(117.00±5.64);造模后灌胃8周,治疗组(87.15±12.74)低于模型组(117.54±5.05);以上数据经统计学处理,均存在显著性差异,p<0.05。空间探索实验结果显示:不同时间点平均跨越平台次数比较,造模后7天(灌胃前),模型组(3.15±0.12)和治疗组(2.89±0.09)的平均跨越平台次数均低于假手术组(8.20±0.21);治疗组在造模后灌胃4周(4.16±0.18)明显高于造模后7天(灌胃前);造模后灌胃8周,治疗组(6.21±0.25)高于模型组(3.52±0.23);以上数据经统计学处理,均存在显著性差异,p<0.01或p<0.05。2.4海马神经细胞病理学观察结果正常组:椎体细胞排列整齐,细胞形态完成、轮廓清晰,细胞核结构清晰,核仁清楚。模型组:椎体细胞稀疏,排列松散不规则,细胞间距增宽,椎体细胞体积变小,核体积变小,染色加深,核仁欠清晰,部分细胞坏死。假手术组:椎体细胞排列整齐,细胞形态完成、轮廓清晰,细胞核结构清晰,核仁清楚。治疗组:与模型组比较椎体细胞排列较整齐,细胞密度增加,细胞形态完整、轮廓较清晰,核体积增大,核仁比较清楚,较模型组差别明显。2.5荧光染色的海马神经细胞凋亡结果采取tunel荧光染色后光镜下观察,凋亡细胞呈绿色。各时间点细胞凋亡情况如下:造模后7天(灌胃前):模型组(120.35±29.24)较假手术组(23.22±12.35)细胞凋亡数显著增加;造模后灌胃4周,治疗组(85.74±25.49)比模型组(123.59±27.24)细胞凋亡数明显低;造模后灌胃8周,治疗组(54.86±23.59)比模型组(130.76±30.08)细胞凋亡数显著降低;以上数据经统计学处理,均存在显著性差异,p<0.01或p<0.05。2.6大鼠mekk2、mekk3和mek5、erk5蛋白表达结果(免疫组织化学)各组mekk2表达水平的比较:造模后灌胃4周,治疗组(2.1250±0.2830)高于模型组(0.6000±0.4083),经统计学分析,p<0.01。各组mekk3表达水平的比较:造模后灌胃8周,模型组(0.3542±0.3753)低于假手术组(0.8333±0.6986),差异明显,具有统计学意义,p<0.05。各组mek5表达水平的比较:造模后灌胃4周,治疗组(1.800±0.1375)高于模型组(0.6000±0.2819),经统计学分析,p<0.05;造模后灌胃8周,治疗组(1.2368±0.5482)高于模型组(0.5100±0.3389),经统计学分析,p<0.05。2.7mekk2、mekk3和mek5、erk5蛋白表达(westernblot)各组mekk3表达水平的比较:造模后灌胃8周,模型组(0.3312±0.2790)低于假手术组(0.5721±0.4345),治疗组(0.5787±0.3650)高于模型组(0.3312±0.2790);以上数据经处理,存在明显差异,p<0.05。各组mek5表达水平的比较:造模后灌胃4周,模型组(0.1927±0.1100)低于假手术组(0.4521±0.2666),治疗组(0.3928±0.2766)高于模型组(0.1927±0.1100),以上数据,经统计学分析,p<0.05。结论:通过理论研究,深入探讨vd的病因病机,提示“肾精亏虚”是vd的基本病机,“补肾法”可以有效改善vd的临床症状,加减薯蓣丸在vd发生基础为“肾精亏虚、痰瘀阻络”的理论指导下,可以治疗vd的相关症状。改良2-vo模型提高了模型动物的存活率,且模型病变特点符合vd模型特点,通过本模型,可以深入探讨vd的发生机制。模型组发生的大鼠生存状态、行为学改变、海马组织结构改变以及下调mekk2、mekk3和mek5、erk5蛋白的表达,使erk5/bmk1信号通路下调,抑制海马神经元的再生,这可能是大脑缺氧缺血后发生vd或者加重vd进程的重要分子机制之一。加减薯蓣丸改善了vd大鼠的生存状态,改善了vd大鼠学习记忆能力,改善了海马组织结构紊乱情况,减少了海马神经细胞的凋亡,并较模型组明显上调了erk5特异上游蛋白mek5的表达,从而激活了erk5/bmk1信号通路,促进海马神经元的再生,这可能是加减薯蓣丸治疗vd的作用机制之一。加减薯蓣丸通过抑制erk5/bmk1信号通路下调促进海马神经元的再生及修复可能是其发挥治疗vd作用的生物学基础。