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目的:制备抗GPC3单克隆抗体和多克隆抗体,并建立GPC3 ELISA检测方法,探讨其在原发性肝癌血清学诊断中的应用价值。
方法:分别构建Glypican-3基因1333-1548 bp片段及73-1074bp片段的原核表达质粒pET22b-GPC3(1333-1548bp)和pProEX Hta-GPC3(73-1074bp)，异丙基硫代-β-d-半乳糖苷( IPTG) 诱导蛋白表达，并用Ni-NTA 树脂亲和层析柱纯化蛋白。利用纯化的GPC3蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经过HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化，制备抗GPC3的单克隆抗体，用ELISA、Western blot进行特性鉴定。化学合成多肽GPC3-Ag1（73－86aa）CCSRKMEEKYQLTh和多肽GPC3-Ag3（382－396aa）ETLSSRRRELIQKLK，并分别与KLH偶联。利用偶联好的多肽GPC3-Ag1、GPC3-Ag3及纯化的GPC3蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，制备抗GPC3的多克隆抗体。从上述多克隆抗体和单克隆抗体中通过不同的抗体组合检测阳性血清和阴性血清筛选最佳配伍抗体；通过棋盘滴定法确定包被抗体的最佳包被浓度和检测抗体的最佳稀释度，根据上述实验选择最优条件建立双抗体夹心ELISA方法。利用上述建立的ELISA方法，检测HCC、肝炎、肝硬化、其他恶性肿瘤肝转移患者及正常人血清，通过ROC曲线选择最佳诊断界值，探讨血清GPC3在HCC诊断中的应用价值。最后我们检测了151例HCC患者血清AFP和GPC3水平，探讨联合检测GPC3+AFP在HCC诊断中的应用价值。
结果:获得11株抗GPC3（25－358aa）单克隆抗体，其中7株为IgG1亚型、4株为IgG2a亚型，轻链均为κ链。7株抗GPC3（444－516aa）单克隆抗体，均为IgG1亚型，轻链均为κ链。获得抗GPC3-Ag1，GPC3-Ag3，GPC3（444aa-516aa）三种多克隆抗体。经Western Blot证实获得单克隆抗体和多克隆抗体均可以特异识别GPC3抗原。成功地建立了双抗体夹心ELISA定量方法，最低检测量为1.6ng/ml，并将其应用于肝癌病人血清GPC3抗原的检测。根据ROC曲线结果，以30ng/ml为诊断界值，364例HCC患者中143例血清GPC3阳性，阳性率为39％；96例肝炎/肝硬化患者中6例血清GPC3阳性，阳性率为6.3％；106例正常人中3例血清GPC3阳性，阳性率为2.8％, 统计学分析表明HCC患者血清和后两组血清GPC3含量有显著差异（P＝0.000）。我们同时检测了151例HCC血清的AFP和GPC3，结果发现单独以AFP为诊断指标时，HCC检出率为49％，单独以GPC3为诊断指标时，HCC检出率为40％，而AFP＋GPC3联合诊断时，HCC的检出率提高到72％。
结论:通过自行制备的抗GPC3单克隆抗体和多克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA方法，该方法可以应用于肝癌病人血清GPC3抗原的检测。GPC3作为一种新的肝癌标志物可以应用于HCC的血清学诊断，特别是联合检测AFP能够显著地提高HCC诊断率。