论文部分内容阅读
目的：在结肠癌SW620细胞系中,探讨protein kinase Cα (PKCα)在TF-Ⅶa-PAR2信号转导轴中是否被激活以及其在结肠癌细胞株增殖、迁移与生存中的作用；进一步分析该过程中PKCa的下游信号分子及其调控的效应分子,以阐明TF-Ⅶa-PAR2-PKCa促进SW620细胞增殖、迁移与生存的分子机制。方法：(1)采用因子Ⅶa (10nM)、PAR2激动剂(PAR2-AP,100μM)以及PKC激动剂佛波酯(PMA,100nM)等处理SW620细胞不同时间,western blot检测其PKCα与p-PKCα的表达,免疫荧光试验观察PKCα的分布情况。(2)借助抑制抗体(α-TF、α-PAR2)同型对照抗体(mopc-21)、PKCα抑制剂(safingol,10μM)及ERK1/2抑制剂(U0126,10μM)进行抑制试验,western blot检测其PKCα与p-PKCα, ERK1/2与p-ERK1/2以及NF-κB与P-NF-κB的表达,探讨PKCα_上下游的信号分子。(3)采用PMA(100nM), Ⅶa (10nM)及PKCα印制剂(safingol,10μM)等不同组合刺激SW620细胞后,MTT探测细胞增殖能力,Transwell试验检测细胞迁移潜能,流式细胞术(FCM)评估细胞的生存能力。(4)采用Ⅶa (10nM) PKCα抑制剂(safingol,10μM)以及NF-κB抑制剂(PDTC,5μM)等不同组合刺激SW620细胞后,实时荧光定量PCR与western blot检测MMP-9, caspase-3, TF,与Bcl-2/Bax的表达,TF活性检测试剂盒检测TF活性。结果：(1)与]medium组比较,Ⅶa (10nM)、PAR2-AP (100μM)及PMA (100nM)均能明显促进PKCα的磷酸化,而对PKCα的表达没有显著性影响。免疫荧光结果表明,medium组PKCα主要分布在胞浆,分布无明显规律,核内未探测到PKCα的表达；Ⅶα、 PAR2-AP、PMA处理组的PKCα主要分布在核周,并且核内亦有少量表达。(2)与medium组比较,抗TF或抗PAR2抗体均能明显减弱Ⅶa与PAR2-AP诱导的p-PKCα的表达(p<0.05),而同型对照抗体(mopc-21)则没有这种抑制效果(P>0.05)。与Ⅶa处理组比较,PKCα抑制剂(safingol,10μM)能显著抑制Ⅶa对下游信号分子ERK1/2及NF-κB的磷酸化(p<0.05)。(3)与medium组比较,Ⅶa (10nM)及PMA (100nM)均能明显促进细胞的增殖、迁移与生存(p<0.05)；这一促进增强作用能被PKCα印制剂(safingol,10μM)阻断(p<0.05)。(4)与medium组比较,Ⅶa (10nM)能诱导caspase-3与Bax表达明显下调,MMP-9、TF与Bcl-2表达以及TF活性明显上调,这一诱导作用能被PKCα抑制剂(safingol,10μM)与NF-κB抑制剂(PDTC,5μM)阴断(p<0.05)结论：(1)在结肠癌细胞株SW620中,PKCα能够被因子Ⅶa与PAR2-AP激活。(2)Ⅶa依赖TF及PAR2激活PKCα,进而活化下游的ERK1/2与NF-KB。(3)PKCα激活对于因子Ⅶa促进SW620细胞的增殖、迁移与生存是非常必要的。(4)PKCα激活参与了因子VIIa诱导的MMP-9、caspase-3、TF与Bcl-2/Bax效应分子表达。