孕激素和多种生殖过程的调节有关,如：卵泡的生长、卵母细胞成熟、排卵、种植及妊娠的维持等,也是正常乳腺和乳腺癌的重要调节因子。传统的观念认为甾体激素通常通过其核受体发挥其基因转录的功能,然而,孕激素也可以在细胞核外的浆膜和胞浆发挥其快速的非基因组作用。已经发现孕激素有多种快速的非基因组调节功能,涉及到卵母细胞成熟的诱导、大脑生殖信号的调节、乳腺癌细胞信号的快速激活、顶体反应的诱导等。孕激素通过与孕激素受体(progesterone receptor, PR)结合发挥其生理作用。分布在胞核的PR主要有两种：PR-A和PR-B。近些年来发现了一些新的PR受体类型,包括PR-C、PR-M、膜PR (membrane progestin receptor, mPR)和孕激素受体膜元件1(progesteronereceptor membrane component 1, PGRMC1)。还有另外两个转录本PR-S、PR-T。这些非核受体的功能正处于研究之中。传统的核受体PR-A和PR-B的结构中含有与核受体转录功能相关的重要部分,包括配体结合结构域(Ligand-binding domain, LBD)、铰链区(hinge region,H、DNA结合结构域(DNA binding domain,DBD)和转录激活功能(activation function, AF)区域AF-1、AF-3。PR-A和PR-B在胞浆与热休克蛋白结合,和配体结合后与热休克蛋白分离,形成二聚体进入胞核与核内特定DNA上的类固醇激素反应元件结合,启动并调控相关基因的转录。研究发现核孕激素受体(nuclear progestin receptorsn, nPRs)也可以发挥非基因组调节的功能。例如其N末端可变区的421—428个氨基酸含有一个多聚脯氨酸SH3结构域的反应基序,该基序可以以SH3结构域替代机制直接调节nPR与非受体酪氨酸激酶Src的SH3结构域的结合,激活Src信号途径。其它的PR主要分布在细胞核外的浆膜,通过调节离子如钙的流动或激活第二信使影响细胞内的过程。发挥孕激素快速作用的受体主要有三种：(1)mPRs;通过G蛋白耦联受体信号途径发挥作用。(2)PGRMCs;通过其跨膜结构中的Src同源结构域激活第二信使(cAMP)。(3)nPRs;通过PR-B氨基末端富含脯氨酸的结构域与Src的SH3结合激活Src/Ras/MAPK、PI3 kinase/Akt和JAK2/Stat3等信号途径。Thomas M. Price实验室从人主动脉和脂肪组织的cDNA文库中克隆到一个新的孕激素受体,命名为PR-M。cDNA长约2230 bp。PR-M是一个截短的PR,含有314个氨基酸,转录起始于npr的外显子4起始部的内含子3,其蛋白质结构的氨基末端包含有一个16个aa的独特的线粒体定位序列(mitochondrial localization sequence，MLS)。经测序鉴定这16个aa与nPR的外显子4～8相连,但是这个PR的亚型缺乏DNA结合结构域和核定位序列(nuclear location signal,NLS)。Westernblot分析PR-M在Sf9昆虫细胞中显示表达为一个38kDa的蛋白。在人主动脉上皮细胞、MCF-10A乳腺上皮细胞、T47D乳腺癌细胞和人的精子等多种细胞中均发现有PR-M的转录本和蛋白。采用激光共聚焦显微镜发现标记PR-M的绿色荧光蛋白(green fluorescen protein,GFP)存在于Hela细胞的线粒体。线粒体是细胞内必不可少的细胞器,与细胞内能量的产生和细胞的程序性死亡(PCD, programmed cell death) (即凋亡)有关。诱导细胞凋亡的途径主要有两种：外在途径和内在途径。死亡受体(Fas, TNF and TRAIL)和浆膜上的配体结合后形成死亡诱导信号复合物(death-inducing signalling complex, DISC)或激活caspase8启动外在途径,使线粒体膜势能(mitochondrial transmembrane potential, MTP)减弱,释放细胞色素C进入胞浆,激活caspase级联反应。内在途径即线粒体凋亡途径,线粒体的渗透性为内在性凋亡调节的重要环节,它取决于Bc1-2家族促凋亡和抗凋亡因子之间的比率。死亡信号(如DNA损伤)诱导促凋亡蛋白BH3结构域发生结构上的改变,然后转移到线粒体外膜(outermitochondrial membrane, OMM),形成线粒体通透性转换孔(permeability transition pore, PTP)或电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channels,VDAC),导致MTP的快速丢失,膜渗透性增加,基质水肿,OMM破裂并释放细胞色素C、Smac/DIABLO等促凋亡物质释放入胞浆,通过激活Apaf-1,最终激活caspase-9、caspase-3效应因子,导致细胞的碎裂；同时解除了IAPs对凋亡的抑制。两种途径均通过影响线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)而发挥作用。PR-M可能在调节线粒体膜电势方面发挥其独特的作用,这种作用已经在(?)Price TM小组对良性乳腺癌细胞系MCF10A一系列的实验中显示出来。MCF10A是一种缺乏孕激素核受体表达但却有PR-M表达的乳腺非肿瘤上皮细胞。用孕激素(P4)或特异的孕激素受体激动剂R5020处理MCF10A细胞后,细胞MMP呈计量依赖性增加,与细胞内ATP的增加一致,应用孕激素受体拮抗剂RTI-6413-049b可以抑制孕激素诱导的线粒体超极化反应。实验显示孕激素诱导的MMP超极化与地塞米松和放线菌酮Cycloheximide (CHX)的作用无关,表明孕激素诱导的线粒体膜电位的增加并非糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptors, GRs)的交叉反应,而且不依赖于蛋白质的合成。进一步实验证明R5020可以抑制FasL诱导的MCF10A细胞的凋亡,同时伴随有caspase-3、caspase-7活性的下调。另外,采用RNAi技术对PR-M的调节作用进行研究发现,敲除T47D乳腺癌细胞中的PR-M后,PR-M的表达减弱,孕激素诱导线粒体膜电位增加的作用减弱；但敲除PR-A和PR-B后却没有这种变化。上述结果表明,孕激素可能通过PR-M增加了细胞线粒体的膜电位及细胞内ATP,从而增加了细胞内呼吸。孕激素可能通过增加细胞呼吸促进了即将凋亡细胞的生长,抑制了线粒体调节的凋亡。但孕激素通过何种机制影响了线粒体的膜电位,以及其具体的抑制凋亡的途径尚不清楚。研究表明PR-M的富集与线粒体的分布有关,PR-M在心脏、肝脏和子宫平滑肌中有高表达。本研究着重于PR-M对子宫平滑肌的作用,其目的为：(1)比较PR-M在子宫肌瘤及其邻近正常子宫平滑肌组织中的表达；(2)了解孕激素对原代培养的子宫平滑肌细胞以及人永生化子宫平滑肌(hTert-HM)细胞线粒体膜电位的调节作用；(3)研究孕激素诱导的hTert-HM细胞线粒体膜电位超极化反应的机制。本研究分为以下三部分：第一部分孕激素受体亚型PR-M和线粒体porin蛋白在子宫肌瘤及其邻近正常子宫平滑肌组织中的表达方法1.蛋白提取和Western blotting分析选取美国杜克大学医学院妇产科因子宫肌瘤行手术治疗的5例患者的组织标本(组织获取经杜克大学伦理委员会审核批准),术中分别取子宫肌瘤组织近边缘部分(fibroid edge,FE) (肌瘤组)及其邻近子宫肌瘤的正常平滑肌组织(myometrium adjacent,MA) (正常组)各5例,共10例。采用Western blotting检测孕激素受体PR-M、PR-A和PR-B和线粒体porin蛋白在子宫肌瘤和正常子宫平滑肌组织中的表达。标本采集后—80℃保存于OCT冻存液中待用。将组织置于含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中进行高速组织粉碎仪搅拌和超声裂解,用Bradford微孔板检测试剂盒和读板器检测总蛋白浓度(以已知的BSA浓度为标准曲线)。Western blotting分析采用10%的聚丙烯酰胺于Tris/Glycine/SDS缓冲液中电泳分离蛋白,组织上样量为每孔30～70μg,Tris/Glycine缓冲液中转膜,5%牛奶常温封闭1h,按照一定浓度加入一抗4℃孵育过夜。PR-M用MAB462鼠单克隆抗体检测,PR-A和PR-B用C-19兔多克隆抗体检测。Porin采用鼠单克隆porin或VDAC-3抗体检测。以GAPDH做为系统对照。一抗反应后TBST洗膜,分别加入5%牛奶稀释的一定浓度的抗兔或抗鼠二抗,常温下摇床孵育1h。将膜用ECL增强化学发光剂快速摇洗1min后显影。每次检测后用蛋白印迹膜再生液洗膜。重复取样,PR-M蛋白检测实验重复4次,共行20例次；PR-A和PR-B重复2次,共行10例次。以乳腺癌T47D细胞做为阳性对照。2.蛋白表达的半定量分析采用多图像光柜过滤系统(MultilmageTM Light Cabinet Filter Position) Alpha lamagerTM 2200行半定量分析。图片扫描获得IDV (Integrated Density Value)值,分别将PR-M. PR-A, PR-B、porin的IDV值与GAPDH的IDV值相比。将两组PR-M、PR-A、PR-B、porin的IDV与GAPDH的IDV比值均值进行统计分析。结果1. PR-M、PR-A和PR-B在子宫肌瘤及其邻近正常子宫平滑肌组织中的表达子宫肌瘤组PR-M/GAPDH的IDV比值高于正常组,差异有统计学意义(P=0.007)。分别将PR-A、PR、PR-M的IDV值与GAPDH的IDV值相比,并设定正常组的IDV的比值为1,5例患者中4例PR-M/GAPDH的IDV比值明显大于1。子宫肌瘤组PR-A/GAPDH和PR-B/GAPDH的IDV比值也高于正常组,但差异无统计学意义(P=0.153,P=0.052)。2. porin在子宫肌瘤及其邻近正常子宫平滑肌组织中的表达子宫肌瘤组porin/GAPDH的IDV比值高于正常组,差异有统计学意义(P=0.003)。分别将porin的IDV值与GAPDH的IDV值相比,并设定正常组的IDV的比值为1。5例porin/GAPDH的IDV比值均大于1。3. PR-M, PR-A和PR-B和porin的相关性Spearman’s相关性分析时,PR-M/GAPDH与porin/GAPDH之间呈正相关(rs=0.359,P=0.023)。但PR-A/GAPDH、PR-B/GAPDH与porin/GAPDH之间无相关性(rs=0.068、-0.009,P=0.777、0.970)第二部分孕激素对原代子宫平滑肌细胞和永生化子宫平滑肌细胞(hTert-HM)线粒体膜电位的调节方法1. Western blotting检测PR-M和porin蛋白在原代培养子宫平滑肌细胞和hTert-HM细胞中的表达选取美国杜克大学医学中心因子宫肌瘤行手术治疗患者的正常子宫组织行子宫平滑肌原代细胞培养。手术后将标本立即置入无钙无镁加双抗的HBSS液体中,用加双抗的无血清DMEM/F12、0.1% I A型胶原蛋白酶Ⅰ消化细胞,用适量DMEM/F12培养基(+10%FBS+1%双抗和0.5%Fungizone)进行细胞培养。分别对手术后立即消化的原代子宫平滑肌细胞、生长了5天的原代子宫平滑肌细胞、传代前的子宫平滑肌细胞和第三代培养子宫平滑肌细胞进行Western blotting检测(方法同上述)。PR-M用MAB462、C262抗体检测。hTert-HM永生化子宫正常平滑肌细胞株为美国杜克大学生殖内分泌实验室保存提供。Westem blotting检测PR-M和porin蛋白在hTert-HM细胞中的表达。2.RT-PCR检测PR.M mRNA在hTert-HM细胞中的表达用TRIzol试剂对永生化子宫平滑肌细胞进行总RNA的提取,提取物进行逆转录为cDNA,行PCR扩增反应。PCR产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳,显色分析。T47D乳腺癌细胞为阳性对照。阴性对照用水替代cDNA。3.JC-1实验检测P4和R5020对原代培养子宫平滑肌细胞线粒体膜电位的作用用适量DMEM/F12培养基(+10%FBS+1%双抗和0.5%Fungizone)对切除的正常子宫平滑肌组织进行原代细胞培养,细胞按120k/孔铺于48孔板,生长4天,至80%密度时放入pH 7.4的KRH缓冲液(含25 mM Na-HEPES,115 mM NaCl, 5 mM KCl,1 mM KH2P04,1.2 mM MgSO4,0.5 mM CaCl2 and 5 mM glucose)在无C02的37℃孵育箱中孵育2h后,分别用10-6M、10-8M和10-10M的P4诱导细胞60min。第一代细胞生长7天后传代,第二代细胞按40000/每孔铺于48孔板,3天后分别应用10-6M和10-7M的R5020诱导细胞60min。采用Jc-1(5,5’,6,6’-tetrachloro- 1,1’,3,3’-tetraethyl-benzimidazole- carbocyanide iodine,5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基-苯并咪唑-碳氰碘化物)实验检测孕激素作用后细胞MMP的变化。4.JC-1实验检测R5020、MPA和P4对hTert-HM细胞线粒体膜电位的作用用适量DMEM/F12培养基(加10%胎牛血清和青霉素、链霉素双抗)对hTert-HM细胞进行细胞培养,细胞按50K/每孔的密度铺于48孔板,生长24h至80%密度时行JC-1实验。分别应用10-8M的R5020、MPA和P4,以及10-6M、10-8M和10-10M的R5020诱导细胞60min后采用JC-1检测细胞MMP的变化。结果1.PR-M、porin和α—SMA蛋白在原代培养子宫平滑肌细胞中的表达Westem blotting结果显示手术后立即消化的原代子宫平滑肌细胞、生长了5天的原代子宫平滑肌细胞和传代前的子宫平滑肌细胞中均有PR-M蛋白和Porin蛋白的表达,PR-M为一个38kDa的条带,ponn为一个31kDa的条带。2. PR-M mRNA在hTert-HM细胞的表达结果显示hTert永生化子宫平滑肌细胞株中有PR-M mRNA的表达。3.P4和R5020对原代培养子宫平滑肌细胞线粒体膜电位的超极化作用结果显示10-6M,10-8M和10-10M的P4均引起原代培养子宫平滑肌细胞MMP的超极化反应,但10-6M,10-8M与对照组比较差异有统计学意义(Z=3.838,p=0.000; Z=2.914, P=0.004)。Progesterone以浓度依赖的形式引起MMP的增加,浓度越高,其引起的MMP超极化作用越强(rs=-0.781,P<0.0001)。10-6M和10-7M的R5020引起第二代原代培养子宫平滑肌细胞MMP的超极化反应,但与对照组比较差异无统计学意义(F=1.511，p=0.253)4.R5020、MPA和P4对hTert-HM细胞线粒体膜电位的超极化作用R5020、MPA和P4三种孕激素在10-8M的浓度时均引起hTert-HM细胞MMP的超极化改变(p=0.031,0.001,0.203)。人工合成的孕激素R5020和MPA可以明显引起hTert细胞MMP的超极化反应。第三部分孕激素诱导的hTert-HM细胞线粒体膜电位超极化反应的机制方法1.JC-1实验检测孕激素受体拮抗剂RTI-6413-049b作用后的hTert-HM细胞线粒体膜电位hTert-HM永生化子宫正常平滑肌细胞株为杜克大学生殖内分泌实验室提供。用适量DMEM/F12培养基(加10%胎牛血清和青霉素、链霉素双抗)对hTert-HM细胞进行细胞培养。细胞按50K/每孔的密度铺于48孔板,生长24h至80%,然后放入KRH缓冲液2h,分别应用加有和不加10-6M的孕激素受体拮抗剂(RTI-6413-049b),以及10-6M的RTI诱导hTert-HM细胞60min后采用JC-1检测细胞MMP的变化。2.JC-1实验检测地塞米松(Dexamethasone)作用后的hTert-HM细胞线粒体膜电位细胞按50K/每孔的密度铺于48孔板,生长24h至80%,放入缓冲液2h后,分别应用10-8M,10-9M,10-10M的Dexamethasone诱导hTert-HM细胞60min后采用JC-1检测细胞MMP的变化。3.JC-1实验检测放线菌酮Cycloheximide(CHX)作用后的hTert-HM细胞线粒体膜电位hTert-HM细胞按50K/每孔的密度铺于48孔板,生长24h至80%,分别放入含有5μg/mL CHX缓冲液和不含CHX缓冲液中2h后,分别用加有和不加CHX(5μg/ml)的10-6M的R5020、CHX(5μg/ml)诱导细胞60min,应用JC-1检测MMP的变化。4. Western blotting检测TGF-β1作用于hTert-HM细胞后CHX对Id-1蛋白表达的抑制作用细胞按800k/每孔铺于6孔板上,分别加含有5μg/mL的CHX的缓冲液和不含CHX的缓冲液中孵育2h后,加入5ng/mL TgF-β1处理60min后收集细胞,应用western blotting检测Id-1蛋白的表达。结果1.RTI作用后hTert-HM细胞线粒体膜电位的改变10-8M R5020引起的超极化反应与联合应用10-8M R5020和10-6M RTI组、单用10-6MRTI组、对照组之间相比差异均有统计学意义(P=0.033,0.017,0.005)。联合应用10-8M R5020和10-6M RTI组,以及单用10-6MRTI组,与对照组比较时差异无统计学意义(P=0.394,0.549)。表明,R5020引起的细胞MMP的超极化反应被RTI所抑制。2. Dexamethasone作用后hTert-HM细胞线粒体膜电位的改变10-8，10-9，10-10浓度的地塞米松与对照组各组间比较均无统计学意义(F=0.722，p=0.541)。表明,地塞米松对hTert细胞的MMP没有作用。提示,孕激素引起的hTert-HM细胞线粒体膜电位的超极化可能与糖皮质激素受体的作用无关。3.CHX作用后hTert-HM细胞线粒体膜电位的改变10-6M R5020组、以及联合使用10-6M R5020和CHX(5μg/ml)组,与对照组比较差异均有统计学意义(P=0.026,0.006)；单用CHX组与对照组之间比较差异无统计学意义(p=0.246)；10-6M R5020组与联合使用10-6M R5020和CHX组之间比较差异也无统计学意义(p=0.600)。表明,转录抑制剂CHX对hTert细胞MMP没有影响,应用CHX后不影响10-6M R5020引起的hTert细胞MMP的超极化作用,R5020的作用与细胞蛋白合成无关。4.CHX及TGF-β1作用后hTert-HM细胞中Ib-1蛋白的表达TgFβ-1作用于细胞后,在一定时间内(1h左右)可以诱导细胞产生Id-1,CHX可以抑制该过程。为证明CHX对hTert细胞抑制作用的有效性,我们采用CHX (5μg/ml)孵育细胞2h后再用TgFβ-1 (5ng/ml)处理细胞60min,Westernblotting显示CHX处理后Id-1蛋白的表达减弱,表明CHX发挥了抑制作用。统计学处理采用SPSS 16.0对数据录入分析,正态分布数据以x±s表示,非正态分布数据以M±Q表示。配对比较采用配对t检验。数据服从正态分布且方差齐多个样本均数比较采用方差分析法,两两比较采用最小显著差异法(least significant difference,LSD),否则多组比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。采用Spearman进行等级资料数据的相关分析。检验水准α=0.05。结论1.线粒体孕激素受体PR-M在人子宫平滑肌组织中呈高表达,其在子宫肌瘤组织中的表达高于临近的正常子宫平滑肌组织。2.孕激素以剂量依赖的形式诱导了原代培养和永生化子宫平滑肌细胞线粒体膜电位的增加。这种反应可以被孕激素受体拮抗剂所抑制,但与糖皮质激素和放线菌酮的诱导无关,排除了糖皮质激素受体作用和蛋白合成抑制的可能性。3.研究提示,孕激素可能通过PR-M的非基因组作用增加了细胞的能量代谢,细胞内能量的增加导致了子宫肌瘤的异常增殖。