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目的:
1.验证2型糖尿病(T2DM)易感基因CDKAL1 rs7756992位点和KCNQ1 rs2237892位点与中国汉族人群T2DM的关联。
2.分析rs7756992(CDKAL)和rs2237892(KCNQ1)不同基因型与T2DM临床特征和糖尿病慢性并发症的关联,为浙江省温州地区易感人群的筛选和疾病分子分型提供基础。
3.分析线粒体DNA单核苷酸多态性位点T16189C变异与中国汉族人群T2DM的关联,为T2DM的研究提供新的依据。
方法:
1.研究对象:所有研究对象均来自于浙江省温州地区汉族人群,其中病例组为温州医学院附属第一医院内分泌科住院部2009年3月-2011年10月期间确诊的2型糖尿病患者,而非糖尿病对照组人群为2009年12月-2011年10月期间于温州市体检中心参加体检的体检者。本研究经过温州医学院附属第一医院伦理委员会批准,调查和取样均征得参与者本人同意并签署了知情同意书。
2.标本DNA提取:使用专用的血液DNA提取试剂盒及磁珠提取法,对收集的样本进行全基因组DNA提取,并用NanoDrop2000分光光度计测定其浓度和纯度后,保存在-30℃冰箱备用。
3.基因分型:采用高分辨率熔解曲线(HRM)技术区分样本基因型。首先设计两对HRM特异性引物,然后进行PCR扩增和HRM基因分型,最后使用LightCycler(@)480 Gene scanning软件自动化分组功能进行结果分析。另外,随机抽取病例-对照组标本各20例进行DNA直接测序,验证HRM技术的特异性和灵敏度。
4.PCR扩增技术和DNA直接测序技术:选取包含线粒体DNA16189C和一些多态性位点的特异性引物进行PCR扩增,PCR产物纯化后进行DNA直接测序,测序结果用DNA Star等相关软件与剑桥参考序列进行分析。
5.数据分析:CDKAL1计量资料呈正态分布变量用X±S表示,非正态分布用中位数(四分位间距)表示,而KCNQ1和T16189C的所有计量资料均用X±S表示。两组临床基本特征分析中,非正态分布变量经对数变量变换后转为正态后使用独立样本t检验,而未转为正态的变量用秩和检验,计数资料(性别)用x2检验分析。 Hardy-Weinberg平衡试验检验本研究所选样本是否具有群体代表性。rs7756992位点和rs2237892位点基因型和等位基因频率与T2DM发病风险和糖尿病慢性并发症关联分析用例数(%)表示,使用x2检验和二项Logistic回归分析,与T2DM患者临床特征分析使用单因素方差分析(ANO VA)和多元线性回归分析。16189C和一些多态性位点组成的单体型在病例-对照组中的分布用例数(%)表示,使用x2检验进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义,且所有数据用SPSS17.0软件包统计分析。
结果:
1.在浙江温州地区汉族人群中,CDKAL1基因rs7756992位点基因型GG/AA(P=0.048)和等位基因A/G(P=0.045)在T2DM组和对照组间差异显著,证实G为该位点风险等位基因。
2.对T2DM组内不同基因型的临床特征分析发现,rs7756992位点GG基因型T2DM患者空腹血糖浓度偏低(年龄/性别校正后,P<0.001)而HbAl c值未见差异。
3.T2DM患者中,rs7756992位点等位基因和基因型频率在各种糖尿病慢性并发症间比较差异无统计学意义。
4.在浙江温州地区汉族人群中,KCNQ1基因rs2237892位点等位基因C/T(P<0.001)、基因型CC/TT(P<0.001)、基因型CC/(CT+TT)(P=0.006)和基因型(CC+TT)/TT(P<0.001)在T2DM组和对照组间有显著差异。
5.对T2DM组内不同基因型的临床特征,使用二项Logistic回归,经过性别、年龄和体重指数校正后分析发现,rs2237892位点CC基因型和CT+TT基因型相比,收缩压(P=0.015)以及糖尿病合并高血压(P=0.04)和糖尿病大血管病变(P=0.05)在两者间差异有统计学意义。
6.线粒体DNAT16189C和一些多态性位点(249A-del,12705T,16223T,16298C,16519C)构成的5组单体型在第一组病例-对照组人群中显示与T2DM显著相关,其中249A-del呈负相关,相反,另外4组则呈正相关。
7.第一组和第二组研究对象综合后再次分析线粒体DNA中5组单体型(16189C和249A-del,12705T,16223T,16298C,16519C)与T2DM的关联,结果显示除16189C/16298C单体型在T2DM组和对照组间差异有统计学意义,另外4组差异均无统计学意义。
结论:
1.本研究在浙江温州地区汉族人群中进一步证实了CDKAL1基因rs7756992位点多态性与T2DM发病风险增加的关联;另外,该位点可能对T2DM血糖调节机制有一定影响,这还需要进一步研究。
2.KCNQ1 rs2237892位点可以增加浙江温州地区汉族人群T2DM发病风险;且携带有该位点风险等位基因C的T2DM患者,合并高血压和糖尿病大血管病变的发病增加。
3.线粒体DNA16189C/16298C单体型可能与T2DM的发病风险相关。