目的：辣椒碱（反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺）是辣椒中的主要活性成分。目前，辣椒碱作为抗炎、止痛药物已广泛应用于临床治疗多种疼痛相关的疾病。近年来关于辣椒碱的抗肿瘤特性逐渐受到人们的关注。文献报道了辣椒碱对多种不同组织来源的肿瘤细胞具有毒性杀伤效应。而关于辣椒碱对骨肉瘤细胞毒性作用的相关研究较少。因此，本课题组就辣椒碱对骨肉瘤细胞的毒性效应展开研究。我们使用辣椒碱干预多株骨肉瘤细胞，通过不同检测手段较为全面地观察、验证了辣椒碱对骨肉瘤细胞活性、增殖及凋亡的影响；并进一步探讨了辣椒碱引起骨肉瘤毒性的相关分子机制，旨在为辣椒碱应用于抗骨肉瘤的后续研究提供一定的理论依据。　　方法：体外培养MG63，143B及HOS三株骨肉瘤细胞，予以不同浓度的辣椒碱（0-300μM）分别干预三株细胞，并应用CCK-8检测不同浓度辣椒碱作用于三株骨肉瘤细胞不同时间点后，细胞活性变化情况。同时，通过AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞检测法检测不同浓度辣椒碱处理骨肉瘤细胞后，细胞凋亡的变化情况；另外，为验证细胞凋亡的发生情况，我们还应用caspase-3,caspase-8和caspase-9活性检测试剂盒检测辣椒碱干预骨肉瘤细胞后，细胞中不同caspase活性变化情况。应用线粒体膜电位检测试剂盒JC-1检测不同浓度辣椒碱干预骨肉瘤细胞后，细胞内线粒体膜电位的变化情况；并采用Western Blotting法检测辣椒碱对细胞内凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达调节情况。应用EdU细胞增殖检测试剂盒检测不同浓度辣椒碱干预骨肉瘤细胞后，细胞中DNA复制及细胞增殖的变化情况。采用细胞平板克隆实验，检测不同浓度辣椒碱对骨肉瘤细胞克隆形成的影响。应用流式细胞检测法对骨肉瘤细胞细胞周期分布的进行检测，观察不同浓度辣椒碱对骨肉瘤细胞周期分布的影响；并同时采用Western Blotting检测辣椒碱对骨肉瘤细胞内周期相关蛋白PCNA及P21的表达调节情况。为探寻辣椒碱对骨肉瘤细胞毒性的可能分子机制，我们应用不同浓度的辣椒碱处理三株骨肉瘤细胞后，提取细胞总蛋白，并应用Western Blotting检测细胞内MAPK家族中ERK1/2，p38及JNK三条经典信号通路的激活、抑制情况，探寻MAPK家族信号通路如何参与辣椒碱对骨肉瘤细胞的毒性效应过程。应用细胞内氧自由基检测试剂盒DCFH-DA检测辣椒碱干预骨肉瘤细胞后，细胞内氧自由基的变化情况；另外，联合应用NAC及辣椒碱处理骨肉瘤细胞后，观察细胞内活性氧自由基的变化情况，探寻细胞内氧自由基变化及细胞凋亡的关系。应用NAC及JNK信号通路特异性阻断剂SP600125分别抑制细胞内氧自由的产生及JNK信号通路的激活，并采用Western Blotting检测磷酸化JNK蛋白及凋亡相关蛋白Bax，Bcl-2的表达变化情况，探寻ROS/JNK信号通路在辣椒碱诱导骨肉瘤凋亡过程中所起的作用。　　结果：我们观察到不同浓度辣椒碱（0-300μM）分别干预MG63，143B及HOS细胞12，24及48h后，骨肉瘤细胞活性的下降与辣椒碱的作用呈现出显著的浓度，时间依赖性。从100μM辣椒碱开始，骨肉瘤细胞的活性随着辣椒碱浓度的提升逐渐下降（P＜0.05）；另外在同一浓度下，三株细胞活性随着辣椒碱的干预时间延长逐渐下降（P＜0.05）；而干预时间达24h后，细胞活性下降基本达到平台期。干预24h后，辣椒碱对三株骨肉瘤细胞的IC50均在200μM左右。我们应用AnnexinV-FITC/PI流式细胞检测法检测辣椒碱诱导骨肉瘤细胞凋亡的情况。结果发现，虽然在CCK-8实验中，细胞活性检测从100μM开始就显著下降；但在凋亡检测中，我们观察到在250μM浓度的辣椒碱干预下，三株骨肉瘤细胞才开始发生显著的凋亡（P＜0,05）。我们应用三种caspase检测试剂盒检测不同浓度辣椒碱干预骨肉瘤细胞24h后，细胞内活性caspase的变化情况。结果表明，在250μM辣椒碱的干预下，细胞内活性caspase-3及caspase-9的水平得到了显著提升（P＜0.05）；而不同浓度辣椒碱对三株细胞内活性caspase-8的水平无明显影响（P＞0.05）。应用JC-1法检测不同浓度辣椒碱对骨肉瘤细胞内线粒体膜电位的改变情况发现，仅在250μM浓度下，辣椒碱能显著降低三株细胞内线粒体的膜电位（P＜0.05）；同时在该浓度下，Western Blotting检测发现，细胞内的促凋亡蛋白Bax显著上调（P＜0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2显著下调（P＜0.05）。至此，我们观察到细胞活性下降结果与细胞凋亡结果不尽一致，由于CCK-8的结果还反映着细胞的增殖状况，因此我们应用增殖检测试剂盒EdU检测了细胞内DNA复制及增殖情况。结果表明，从100μM浓度开始，辣椒碱能逐渐降低三株细胞中EdU阳性细胞的数目，这提示辣椒碱能抑制骨肉瘤细胞的增殖。平板克隆实验同样表明，辣椒碱能有效地抑制三株骨肉瘤细胞的克隆形成能力；当辣椒碱浓度提升到250μM时，三株骨肉瘤细胞几乎无法形成克隆。我们应用流式细胞法检测辣椒碱对骨肉瘤细胞的周期影响发现，从100μM浓度开始，辣椒碱显著地增加了三株骨肉瘤细胞中处于G0/G1期的细胞数目，并相应地减少了处于S期的细胞数目；同时，采用Western Blotting检测周期相关蛋白发现，随着辣椒碱浓度的提升，细胞中p21蛋白表达逐渐提升，而PCNA蛋白表达逐渐下调。为进一步探寻辣椒碱对骨肉瘤细胞毒性作用的相关机制，我们应用Western Blotting检测了不同浓度辣椒碱干预骨肉瘤细胞后，MAPK家族中ERK1/2，p38及JNK信号通路的活化情况。结果表明，辣椒碱能下调三株细胞中ERK1/2及p38的磷酸化水平（P＜0.05），且该效应呈现浓度依赖性；而辣椒碱对JNK的磷酸化水平调节较为特殊，与对照组（0μM）相比，250μM浓度的辣椒碱能显著上调三株骨肉瘤细胞中JNK磷酸化的水平（P＜0.05）。结合之前凋亡检测结果结果，这预示这JNK信号通路可能参与了辣椒碱诱导骨肉瘤细胞凋亡的过程。我们进一步验证辣椒碱处理后，细胞内氧自由基的变化与细胞凋亡的关系，250μM辣椒碱处理骨肉瘤MG63细胞后能显著提升细胞内ROS的水平，同时诱导细胞凋亡；而氧自由基清除剂NAC能抑制辣椒碱处理后细胞内ROS上调（P＜0.05），并极大程度上对抗辣椒碱诱导的细胞凋亡（P＜0.05）。应用Western Blotting检测JNK磷酸化及凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的表达发现，NAC及JNK特异性抑制剂SP600125均能有效地抑制250μM辣椒碱上调细胞内JNK磷酸化水平的效应（P＜0.05），同时也能对抗单独使用辣椒碱对Bax及Bcl-2蛋白的促凋亡调节作用（P＜0.05）。这预示着辣椒碱诱导骨肉瘤凋亡的效应可能依赖于激活细胞内ROS/JNK信号通路。　　结论：辣椒碱能有效地降低多株骨肉瘤细胞的活性；然而辣椒碱仅在相对较高浓度（250μM）的情况下，才能通过内源性凋亡途径发挥促骨肉瘤细胞凋亡的效应。但另一方面，辣椒碱即使在相对低浓度（100μM）的情况下也能显著地发挥着抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导细胞周期阻滞的作用。另外，辣椒碱对骨肉瘤细胞增殖及周期阻滞的效应可能与抑制MAPK家族中ERK1/2及p38信号通路的活化有关。而辣椒碱对骨肉瘤细胞的凋亡效应则可能依赖于激活细胞内ROS/JNK信号通路。