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特应性皮炎（Atopic Dermatitis,AD）是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病,患者往往伴有剧烈瘙痒,严重影响生活质量。全球儿童特应性皮炎患病率为10%～30%,成人特应性皮炎患病率为2%～10%。各种研究表明特应性皮炎发病机制复杂,涉及遗传、皮肤屏障破坏、感染以及免疫失衡等多种因素,可激活多种免疫和炎症通路。近年来研究表明特应性皮炎的免疫学发病机制与细胞因子的分泌异常相关。磷酸二酯酶4（Phosphodiesterase 4,PDE4）在调节特应性皮炎炎症相关的炎症级联反应中发挥作用,是理想的特应性皮炎治疗靶点。为筛选出更安全、更有效的PDE4抑制剂,本课题建立了高通量体外活性筛选模型对候选化合物进行筛选,并对筛选出来的化合物进行药效验证。研究内容如下:1)体外活性筛选模型的构建:参照BPS（BPS bioscience,美国一家试剂公司）公司的PDE4B2 Assay Kit说明书建立以荧光偏振法为检测方法的PDE4抑制剂体外筛选平台。酶优化后浓度为12.41 pg/μL（R2=0.9900）,并进行方法学验证,特异性、批内精密度（RSD%）和批间精密度（RSD%）均满足接受标准。2)化合物体外活性筛选:根据已经建立的体外活性筛选模型,对20个化合物进行初步筛选,按照预先定好的筛选标准[IC50优于Roflumilast(IC50=2.77n M)或与其相当,按照3倍实验误差为可接受的实验误差,即IC50<8.31n M],结果可见,Example-7(IC50=0.470 n M)和Example-17(IC50=3.680 n M)符合筛选标准。3)化合物细胞毒性评价:待测化合物分别与HSF和Ha Ca T共培养,24小时后加入阿尔玛蓝检测细胞活力。结果表明,化合物Example-7和Example-17对HSF和Ha Ca T细胞均无明显毒性。4)化合物对细胞因子的抑制效果评价:提取人外周血单个核细胞,加入待测化合物与h PBMC预孵育30分钟,然后加入刀豆蛋白A刺激,培养48小时后收集上清用免疫酶联试剂盒检测IL-5和IFN-γ浓度。结果显示,Example-7对h PBMC分泌IL-5和IFN-γ的抑制分别为:IC50=2.000n M（R2=0.9634）和IC50=10.11 n M（R2=0.9450）,均优于阳性药AN2728;Example-17对h PBMC分泌IL-5和IFN-γ的抑制分别为:IC50=13.76n M（R2=0.9411）和IC50=11.09n M（R2=0.9452）,均优于阳性药AN2728。5)Example-7急性特应性皮炎药效评价:在佛波酯涂抹的小鼠耳部急性皮炎模型中,阳性药克立硼罗（Crisaborole,AN2728）对耳厚度、耳重量、耳部IL-1β和IL-6分泌抑制率分别为33.2%、26.1%、51.3%和63.7%,与模型组相比,有极显著抑制效果（p<0.01）;同等剂量下,Example-7对耳厚度、耳重量、耳部IL-1β和IL-6分泌抑制效果极显著优于AN2728（p<0.01）,另外,Example-7在小鼠体内血药浓度低,因系统暴露导致的毒副作用风险低。6)Example-7慢性特应性皮炎药效评价:小鼠耳部于预致敏和重复致敏阶段多次涂抹噁唑酮,模拟人类特应性皮炎反复发作的特征,得到与人类特应性皮炎相似程度较高的特应性皮炎模型。在噁唑酮诱导的小鼠慢性AD实验中,与模型组相比,阳性药AN2728和Example-7组从给药第4天开始到实验结束均对耳厚度增加有显著的抑制作用（p<0.05）;在给药第8天,Example-7与AN2728组相比,对耳厚度增加有显著的抑制作用（p<0.05）。另外,阳性药AN2728小鼠血清中Ig E浓度为0.24 ng/m L,Example-7小鼠血清中Ig E浓度为0.20 ng/m L,与模型组相比,AN2728和Example-7对小鼠血清Ig E均有显著性抑制作用（p<0.05）。另外,Example-7在小鼠体内血药浓度低,因系统暴露导致的毒副作用风险低。7)Example-7对卡泊三醇诱导TSLP分泌的抑制效果评价:在卡泊三醇诱导小鼠TSLP分泌实验中,与模型组相比,阳性药AN2728对小鼠耳部TSLP分泌的抑制率为87.9%,有极显著地抑制作用（p<0.01）。Example-7组对小鼠耳部TSLP分泌的抑制率为98.4%,与模型组比较,有极显著抑制效果（p<0.01）,同等剂量下,Example-7对小鼠耳部TSLP分泌的抑制效果极显著优于AN2728（p<0.01）。结论:建立了PDE4筛选平台,筛选获得了Example-7和Example-17。其中,Example-7显示出对免疫细胞分泌炎症因子具有强抑制活性,在急性AD、慢性AD和TSLP模型中均表现出良好的治疗效果。Example-7未显示出明显的细胞毒性,血药浓度低,系统暴露毒性风险低。