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目的:在全球范围内,胰腺癌是一种高度致命性的恶性肿瘤,其预后极差,被诊断后其总体5年生存率低于5%。手术切除仍为目前主要治疗胰腺癌的方法。然而,只有10-20%的患者可以进行手术,50%左右的患者已发生远处转移,35%左右的患者伴有局部侵袭(无法切除)。尽管医学界仍全心致力于胰腺癌的形成演变及其侵袭过程的研究,但胰腺癌的临床疗效并不乐观,也尚未明确胰腺癌侵袭转移具体的分子生物学机制。整合素蛋白α6β4是一种细胞粘附分子,与细胞外基质中的层粘连蛋白结合并形成半桥粒。在许多人类恶性肿瘤中,整合素α6β4的过度表达与肿瘤的侵袭行为和不良预后有关。在肿瘤的发展过程中,整合素α6β4从半桥粒释放,促进肿瘤发生发展,包括维持增殖信号、浸润和转移、逃避凋亡和刺激血管生成等。整合素通过与EGFR、ErbB-2和c-Met等生长因子受体合作,放大下游信号转导通路,如PI3K、AKT、MAPK和Rho家族小GTP酶。此外,它调控侵袭和转移相关蛋白(如S100A4和autotaxin)的启动子DNA去甲基化,上调和激活关键的促肿瘤转录因子,如NFAT和NF-κB。众所周知,蛋白质位点的特异性磷酸化在调节细胞功能方面起着重要作用。可见,明确肿瘤细胞内在的磷酸化作用,绘制蛋白磷酸化谱很有必要。据悉,胰腺癌领域暂无针对同源性细胞系(PC-1.0、PC-1)及其蛋白磷酸化谱相关的报道。本研究借助磷酸化蛋白芯片技术对PC-1.0以及PC-1细胞中表达水平不同的蛋白作了筛选,同时对452个蛋白上的582个磷酸化位点作了合理的对比。整合素β4(ITGB4)酪氨酸1510(Tyr1510)位点在PC-1.0细胞中的磷酸化比率高于PC-1细胞。然而,ITGB4的磷酸化位点通常集中在苏氨酸1356、1360和1364上。这些磷酸化位点可促进整合素α6β4从半桥粒(HDs)释放并促进肿瘤进展。而且,ITGB4的下调能够抑制胰腺癌细胞的转移。此外,ITGB4通过在胰腺癌细胞中靶向p-MEK-1(T292)和ERK1/2来抑制MAPK途径。此外,一项机制研究显示,MAPK和TGF-β途径的双向影响促成ITGB4诱导的胰腺癌细胞侵袭。使用人类蛋白质谱数据库,我们发现ITGB4 mRNA水平较低的患者总生存率较高。总的来说,本研究表明ITG4在Tyr1510位点的特异性磷酸化可以促进胰腺癌侵袭和转移,并提供治疗ITGB4相关癌症的治疗策略。研究方法:采用仓鼠胰腺癌细胞株PC-1和PC-1.0以及人类胰腺癌细胞株Aspc-1和Capan-2。PC-1和PC-1.0细胞裂解产物均使用探针抗体芯片(Full Moon Biosystems,Sunnyvale,CA,USA)予以测定。借助抗体列阵工具来对提取出的细胞裂解液(含不同蛋白酶以及磷酸酶抑制剂)进行分析。根据厂家的要求和说明来完成操作。选用GenePix 4000扫描仪对芯片检测分析,并利用GenePix Pro6.0(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)来对图像进行处理。芯片结果均由Western Blot予以验证。用Western Blot及PCR检测经siRNA瞬势转染前后PC-1.0和Aspc-1中ITGB4的表达情况。用Transwell和Wound Healing实验检测经ITGB4-siRNA瞬势转染前后PC-1.0和Aspc-1的侵袭、迁移能力变化。显微镜下观察经ITGB4-siRNA瞬势转染前后的PC-1.0和Aspc-1细胞形态学变化。Western Blot检测MEK1,MEK2,p-MEK1(Thr292),p-MEK1(Thr386)和p-MEK2(Thr394),ERK1/2,p-ERK1/2的表达。结果:1、利用磷酸化蛋白芯片来对1318个靶点作了分析,以2倍的表达差异作为纳入标准。入选蛋白共计57种,PC-1.0中有32种蛋白的表达水平相较于PC-1明显更高;另外25种蛋白的表达水平则相对下降。2、为检验蛋白芯片最终的磷酸化结果,我们从中选择了6种蛋白并借助Western Blot来检测实际的表达水平。实验得知:PC-1.0细胞中有6种蛋白表达显著地上升,和芯片结果相符,验证了芯片结果的真实性。在高侵袭转移性胰腺癌细胞(PC-1.0和Aspc-1)中,ITGB4的Tyr1510位点被超磷酸化。3、在用si-ITGB4转染后,高度侵袭转移性胰腺癌细胞(PC-1.0和Aspc-1)中的ITGB4在Tyr1510位点磷酸化水平下调。4、经ITGB4-siRNA转染的高度侵转移性胰腺癌细胞(PC-1.0和Aspc-1)的迁移和侵袭能力被抑制。5、ITGB4表达被抑制的PC-1.0和Aspc-1细胞在培养皿中以聚集或成簇的方式生长,同时细胞伪足被减弱或消失。6、在PC-1.0和Aspc-1细胞中,抑制ITGB4的Y1510位点磷酸化导致p-MEK-1(T292)和ERK1/2的表达水平显著降低(P<0.05)。结论:1、ITGB4的Tyr1510位点在高侵袭转移性胰腺癌细胞系(PC-1.0和Aspc-1)中过度磷酸化。2、抑制ITGB4表达能下调胰腺癌细胞侵袭及转移过程。3、ITGB4通过在胰腺癌细胞中靶向p-MEK-1(T292)和ERK1/2来抑制MAPK通路。