论文部分内容阅读
病理性疼痛严重影响患者生活质量,吗啡等阿片类受体激动剂止痛效果显著,但长期使用易产生药物成瘾和戒断症状,开发安全高效镇痛药物是药物研发的热点和难点。课题组之前的研究表明查尔酮类化合物龙血素B阻断初级感觉神经元电压门控性钠通道,从而产生良好的镇痛效果,很好的揭示了傣药龙血蝎镇痛效应的分子机制。名贵中药甘草具有止咳、平喘、镇痛等功效,研究表明甘草富含查尔酮类化合物,其中甘草查尔酮A、甘草查尔酮B和甘草查尔酮C与龙血素B具有一定的结构相似性,提示三种甘草查尔酮可能具有与龙血素B类似的钠通道阻断活性。本课题拟从分子水平探究三种甘草查尔酮是否能够阻断初级感觉神经元电压门控性钠通道,并从细胞水平检测它们对初级感觉神经元兴奋性的影响,最后从动物行为水平验证它们是否具有镇痛效应。本课题首先对甘草查尔酮A、甘草查尔酮B和甘草查尔酮C进行了理化性质分析和结构鉴定（第2章）。Chem Draw软件分析表明甘草查尔酮A和甘草查尔酮C理化性质相似,二者与甘草查尔酮B存在一定的差异,提示甘草查尔酮A和甘草查尔酮C可能具有类似的生物活性。核磁共振检测表明三种甘草查尔酮的结构均符合预期,可用于后续的药理学研究。本研究采用全细胞膜片钳技术检测三种甘草查尔酮对小鼠背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）细胞电压门控性钠通道的影响（第3章）。电生理实验表明甘草查尔酮A和甘草查尔酮C均能显著抑制DRG细胞电压门控性钠通道电流,二者作用于DRG细胞的Kd值分别为19.30±2.90μM和9.31±4.95μM,这一共同生理活性符合二者类似的结构与理化性质。相比而言,甘草查尔酮B即使在30μM的高浓度作用条件下,对DRG细胞电压门控性钠通道电流几乎不能产生调节效应,表明甘草查尔酮B不影响DRG细胞电压门控性钠通道的功能。为此,本研究接下来重点探讨甘草查尔酮A和甘草查尔酮C对DRG细胞电压门控性钠通道门控动力学的影响。结果显示,甘草查尔酮A和甘草查尔酮C均使DRG细胞的I-V曲线向去极化方向偏移,增大了钠通道的最大激活和半激活电压值。甘草查尔酮A和甘草查尔酮C均使DRG细胞电压门控性钠通道稳态失活曲线向超极化方向偏移,降低了钠通道的半失活电压值;同时,二者均延长了DRG细胞电压门控性钠通道的半稳态复活时间,甘草查尔酮A延长作用更为显著。最后,本研究以河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）为分子工具,进一步证明甘草查尔酮A和甘草查尔酮C主要阻断了DRG细胞膜上TTX敏感性钠通道。Nav1.7是哺乳动物DRG细胞膜上TTX敏感性钠通道的主要类型,也是开发安全有效镇痛药物的理想靶标。为进一步印证甘草查尔酮A和甘草查尔酮C对DRG细胞内源性TTX敏感性钠通道的阻断作用,本研究在HEK293T细胞膜上外源性表达Nav1.7通道,采用全细胞膜片钳技术检测甘草查尔酮A和甘草查尔酮C对其调节作用（第4章）。电生理实验结果表明甘草查尔酮A和甘草查尔酮C均能显著阻断外源性表达的Nav1.7通道电流,阻断活性以Kd值表示,分别为17.67±4.15μM和5.73±1.53μM。本部分研究同样测试了甘草查尔酮A和甘草查尔酮C对外源性表达的Nav1.7通道门控动力学影响,二者均引起Nav1.7通道的I-V曲线向去极化方向偏移,增大了最大激活和半激活电压值;二者使得Nav1.7通道稳态失活曲线向超极化方向偏移,一定程度降低了Nav1.7通道的半失活电压值;二者一定程度延长了Nav1.7通道的半稳态复活时间。本部分研究结果表明甘草查尔酮A和甘草查尔酮C对外源性表达的Nav1.7通道功能具有较强的抑制作用,较好的重现了二者抑制DRG细胞内源性TTX敏感性钠通道功能的实验现象。Nav1.7通道介导了哺乳动物DRG细胞动作电位的主要离子流,其功能抑制会直接导致DRG细胞兴奋性降低。在本课题的第四部分研究中（第5章）,采用全细胞电流钳实验技术检测了甘草查尔酮A、甘草查尔酮C对小鼠DRG细胞膜电位的影响。实验结果表明甘草查尔酮A和甘草查尔酮C能够显著降低DRG细胞动作电位发放频率,明显减弱动作电位的峰值（Action potential peak,APP）,一定程度增大了DRG细胞动作电位阈值（Action potential threshold,APT）,但不影响DRG细胞静息膜电位（Rest potential,RP）水平。本部分的研究结果提示甘草查尔酮A和甘草查尔酮C能够抑制哺乳动物DRG细胞动作电位的发放,从而降低了DRG细胞的兴奋性,该结果可部分通过草查尔酮A和甘草查尔酮C阻断DRG细胞Nav1.7通道这一分子机制加以解释。前几章的研究结果分别从分子和细胞水平证明甘草查尔酮A与甘草查尔酮C具有的类似的结构和理化性质,两种化合物均能阻断小鼠初级感觉神经元DRG细胞电压门控性钠通道,进而降低DRG细胞的兴奋性,提示二者可能具有一定的镇痛活性。本课题第五部分（第6章）研究选用来源相对丰富的甘草查尔酮A作为代表分子,检测其对福尔马林模型小鼠痛觉行为的影响。既然甘草查尔酮B对DRG细胞电压门控性钠通道没有阻断活性,本部分同时也检测了甘草查尔酮B对福尔马林模型小鼠痛觉行为的影响,以期作为甘草查尔酮A行为学研究的反面例证。福尔马林小鼠模型痛觉行为具有经典的两相反应特征,第一相发生在注射福尔马林的0-10min内,痛觉反应与外周感受神经元痛觉信息传递有关,是本次研究的主要检测指标;第二相反应发生在注射福尔马林15-30min内,此时的痛觉反应原因较为复杂,与多种炎性因子的释放有关。实验结果显示低（25mg/kg）、中（50mg/kg）、高（100mg/kg）三种浓度甘草查尔酮A对于福尔马林痛觉模型小鼠的两相反应均有显著的抑制效果;而三种浓度甘草查尔酮B对模型小鼠的第一相痛觉反应均无抑制作用,仅高浓度组（100mg/kg）对第二相反应产生了抑制效果。甘草查尔酮A和甘草查尔酮B对福尔马林模型小鼠痛觉行为第一相痛觉反应的影响差异显著,很好的印证了二者对小鼠初级感觉神经元DRG细胞电压门控性钠通道功能调节上的差异,证明甘草查尔酮A通过抑制小鼠外周感觉神经元的痛觉信息传递产生镇痛效应。本课题首次报道甘草查尔酮具有阻断小鼠初级感觉神经元DRG细胞电压门控性钠通道的活性,可能是其降低小鼠初级感觉神经元兴奋性进而产生镇痛效应的重要原因,这一发现有助于从分子水平解释名贵中药甘草的镇痛活性。三种甘草查尔酮结构上存在细微的差异,但在调节小鼠初级感觉神经元DRG细胞电压门控性钠通道功能上差异显著,这一构效关系为甘草查尔酮的结构优化提供了重要实验依据。