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目的:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的发病率每年都在增加,有效的治疗一直是医学领域的难题。最近的研究表明,与生长因子整合的3D打印支架可以指导神经突的生长并促进损伤部位的轴突再生。然而,传统的3D打印技术会通过加热、有机溶剂或交联剂等方式降低生长因子的生物活性,导致无法结合生长因子进行控释。低温3D打印可以将生长因子整合到支架中,并在打印过程中保持生长因子的生物活性。我们的目的是通过低温挤出3D打印技术开发一种与脑源性神经营养因子集成在一起的胶原蛋白/壳聚糖支架(collagen/chitosan scaffolds integrated with brain-derived neurotrophic factor by low temperature extrusion 3D printing,3D-CC-BDNF),作为一种新型的人工控释系统来治疗SCI。方法:1.支架的制备和支架力学性能的测定。通过低温挤出3D打印技术制备3D-CC-BDNF。重量法用于测量支架的吸水率,体积法用于测量孔隙率。此外,Instron 5865机械测试仪用于测量支架的压缩模量。为了测量支架的稳定性,通过同步差热分析仪进行了差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)。使用FTIR光谱仪分析支架的FTIR-ATR光谱。2.支架释放BDNF的动力学的测定。根据制造商的说明,使用酶联免疫吸附法(BDNF Immunoassay,R&DSystems?,美国)分析每个时间间隔上清液中BDNF的量。然后计算BDNF释放的累积量和BDNF的量。3.体外支架的细胞相容性测试。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)或者人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)的分离和鉴定。用移液器以1×106/ml的密度将第四代NSCs或HUCMSCs接种到洗涤的支架上。在倒置相差显微镜,扫描电子显微镜,HE染色,荧光显微镜下观察细胞在支架上的形态和生长情况。测定细胞黏附率。NSCs的细胞黏附率计算如下:细胞黏附率=(黏附细胞数/播种细胞数)×100%。CCK-8检测共培养过程中NSCs或HUCMSCs的生存力。4.SCI的造模和支架的移植。挑选成年雌性SD大鼠(220-250g,n=80)。用小剪刀在大鼠T10的水平完全切除2mm的脊髓段建立T10全横断脊髓损伤模型。止血后,立即将支架分别移植到间隙中,以桥接横切组织之间的空间。将所有大鼠随机分为四组:Sham组(仅进行椎板切除术而无SCI,n=20),SCI组(没有移植支架的SCI,n=20),3D-CC+BDNF组(3D-CC+BDNF植入到完全横断的间隙,n=20),3D-CC-BDNF组(3D-CC-BDNF植入到完全横断的间隙,n=20)。5.脊髓损伤修复的检测。行为评估(Basso–Beattie–Bresnahan(BBB)测试和倾斜爬壁试验),电生理研究,MRI,DTI,HE染色,Bielschowsky’s镀银染色,免疫荧光染色,BDA示踪和透射电镜来评估脊髓损伤的修复程度。结果:1.光学显微镜,荧光显微镜,SEM和HE染色的图像显示3D支架是多孔的。3D-CC-BDNF的吸水率低于3D-C-BDNF和3D-C+BDNF的吸水率(P<0.05)。3D-CC-BDNF的孔隙率高于3D-C-BDNF和3D-C+BDNF的孔隙率(P<0.05)。与C+BDNF((16.58±4.70)Kpa),CC+BDNF((28.91±5.31)Kpa)和3D-C-BDNF((53.56±6.01)Kpa)相比,3D-CC-BDNF的弹性模量增大((64.16±5.27)Kpa(P<0.05)。DSC提示纯BDNF的Tm值比3D-CC-BDNF的Tm值低5℃。红外光谱数据表明3D-CC+BDNF和3D-CC-BDNF具有合适的脂溶性和水溶性化学键。3D-CC-BDNF红外光谱在3441.587 cm-1处的吸收峰明显超过3D-CC+BDNF的红外光谱中的吸收峰。2.相比3D-CC+BDNF,3D-CC-BDNF释放更多BDNF,释放的过程更稳定的释放,释放持续更长的时间。3.CCK-8的结果表明,3D-CC+BDNF和3D-CC-BDNF都具有细胞相容性,与3D-CC+BDNF组相比,3D-CC-BDNF组更有利于细胞生长。4.在SCI后1天,所有SCI大鼠的双后肢瘫痪,而Sham组大鼠的双后肢正常。随着时间的流逝,行为评估和电生理研究的结果均表明,与3D-CC+BDNF组相比,3D-CC-BDNF组的大鼠表现出更好的运动功能恢复。造模后8周,MRI和DTI的结果表明,相比移植3D-CC+BDNF,移植3D-CC-BDNF更能促进SCI后神经纤维束的再生。造模后8周,脊髓宏观组织学形态,HE染色和Bielschowsky’s镀银染色和免疫荧光染色表明植入3D-CC-BDNF填充了损伤部位的间隙,促进了神经纤维的再生并加速了突触连接的建立。造模后8周,BDA示踪表明与SCI组和3D-CC+BDNF组相比,在断面(从头端(-1 mm)到尾端(+1 mm))3D-CC-BDNF组的BDA阳性CST纤维显著增加。造模后8周,TEM图像表明植入3D-CC-BDNF可以促进损伤部位神经纤维再生,轴突向内生长以及新再生轴突的髓鞘化。结论:低温挤出3D打印制造的3D-CC-BDNF能促进脊髓完全横断后神经再生和功能恢复。在损伤部位移植3D-CC-BDNF可能是临床治疗SCI的潜在治疗方法。