刺参(Stichopus Japonicus)具有极高的营养价值及经济价值,但由于其自身的自溶特性,造成了巨大的经济损失,严重制约了海参产业健康的、可持续的发展。本课题组前期实验数据表明,刺参自溶过程中伴随着凋亡现象,但其具体发生机制尚未阐明。本文应用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)和流式细胞仪(FCM)技术,首先建立了一种刺参体腔细胞吞噬率的检测方法,确定了体腔细胞是一种理想的刺参免疫应激实验的对象;应用LSCM、FCM、免疫印迹技术和荧光酶标仪等技术,检测刺参经紫外线诱导自溶过程中,其体腔细胞内质网和线粒体应激损伤程度,及其与细胞凋亡的关联。本研究将为刺参保鲜保活的品质控制技术提供一定的理论基础,为进一步从分子水平上研究刺参细胞免疫功能提供科学可靠的依据。具体研究结果如下:1、刺参自溶过程中体腔细胞吞噬率的变化应用FCM和LSCM检测了刺参体腔细胞在体内与体外对荧光微球悬液的吞噬率,优化了刺参体腔细胞吞噬率的检测方法(体外孵育方法)及检测浓度(1:1500),以这一方法测定紫外UVA(15w/m2、30min)照射后静置不同时间,刺参体腔细胞吞噬率、死亡率及凋亡率的变化,发现随静置时间的延长,刺参吞噬率变化与其死亡率、凋亡率成反比,并确定刺参体腔细胞可以作为研究免疫应激反应的实验对象。2、刺参自溶过程中体腔细胞内质网应激与线粒体损伤通过对刺参体腔细胞内质网、线粒体进行结构损伤检测,发现内质网荧光含量明显升高发生在2h,而线粒体荧光含量明显升高在1h时,表明刺参体腔细胞中线粒体结构损伤先于内质网结构损伤发生;对内质网介导凋亡相关蛋白Caspase-12、GRP78以及线粒体膜电位、线粒体复合体I活性的研究发现,Caspase-12与GRP78均在2h开始发生明显跃迁,而线粒体膜电位与线粒体复合体Ⅰ先后在1h与反应初始发生明显的下降,推测线粒体也可能先于内质网发生功能损伤。3、刺参自溶过程中体腔细胞内质网与线粒体内钙离子分布通过对内质网与线粒体内钙离子含量的测定,发现线粒体内钙离子浓度在实验初始阶段(0h)已发生明显变化,内质网中钙离子浓度明显改变发生在2h之后,推测在刺参自溶过程中,线粒体先摄取细胞质中钙离子以维持自身平衡,内质网为维持细胞稳态平衡释放钙离子,导致自身结构功能受损。结果表明,刺参经UVA照射,其体腔细胞凋亡可能经历了内质网与线粒体损伤途径,且随静置时间的延长,内质网与线粒体的损伤程度加重,并且线粒体损伤可能先于内质网损伤发生。