缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage HI：BD)是由于脑组织供血不足引起脑代谢变化而导致的脑组织损害。所谓缺氧指血供中的氧含量减少，缺血指脑血流的灌注量减少，缺氧缺血互为因果【l】。新生儿HIBD是围产期窒息所致的严重并发症，是导致儿童神经系统伤残的常见原因之一，积极防治HIBD对降低死亡率、减少神经系统后遗症的发生具有重要的临床意义。而复制与人类HIBD发病相近的动物模型是上述研究的一个重要基础，对深入研究}tIBD的病理生理过程、发病机制具有重要的现实意义。HmD的发病机制尚不十分明确，但细胞坏死和凋亡是直接导致神经功能缺失的最终原因，因此阻止脑细胞的凋亡成为保护神经细胞功能的重要措施。 CaSp￡Lse家族(半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶)是一类在细胞凋亡程序中起关键作用的蛋白水解酶家族，它与细胞调亡的关系是近年来研究的一个热点。caspase-3是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种死亡受体介导凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。CaSpaSe．9是启动型C￡LspaSe家族的重要成员之一，位于CaSpaSe级联反应的最上游，能在其它蛋白辅助因子的参与下发生自我活化并激活下游的执行型Caspase，如caspaSe．3，后者可特异性地裂解底物使细胞发生生化及形态学改变，最终导致细胞凋亡。高压氧(Hyperbaric oxygen，HBO)可改善机体对氧的摄取率和利用率，增加血氧含量，提高血氧分压，增强氧的弥散能力，从而改善脑组织的微循环和有氧代谢，保护缺氧缺血性脑组织。而且，有研究显示HBO能抑制执行型caspase-3的激活<[2]>，抑制缺氧缺血性脑细胞的调亡。 基于此，本实验以7日龄SD大鼠作为研究对象，制备脑半球HIBD模型，然后予以HBO治疗，并进一步动态检测新生鼠HIBD模型在HBO治疗前、后18h、24h、48h和96h等不同时间段脑海马区和皮层区细胞caspase-3和caspase-9活性蛋白的表达情况。以探讨HBO对缺氧缺血性神经元的保护作用及作用机制，为临床应用HBO治疗HIBD提供有力的理论依据。 目的： 1、观察HBO对缺氧缺血性脑损伤神经元的保护作用。 2、研究HBO对新生大鼠HIBD模型神经细胞凋亡的影响。 3、探讨HBO减轻HIBD后神经细胞凋亡的可能机制。 方法： 1、动物模型的建立：按照文献资料<[3]>建立标准SD大鼠缺氧缺-血性脑损伤(HIBD)模型，并随机分为三组：假手术组(24只、)，HIBD模型组(24只)，HBO干预组(24只)。 1．1 假手术组：仅在乙醚麻醉后作颈部正中切口，分离出左侧颈总动脉后不进行结扎即缝合伤口，不行缺氧处理。 1．2 HIBD模型组：7d龄SD新生大鼠，乙醚(0.3ml/100mg)吸入麻醉， 75％酒精消毒皮肤，行颈部正中切口，长0.5～1cm，分离皮肤及皮下组织，游离出左颈总动脉并用4.0号灭菌丝线双道线结扎，缝合伤口。术后将造模动物置于自制lL容积缺氧仓内，以氧氮混合气(氧浓度8％)lL/min持续灌注2h。缺氧仓置于恒温水浴箱中，维持环境温度在37-37.5℃。缺氧后将新生鼠放回母鼠身边分笼常规喂养。(Fig．1～5)。 1.3 HBO干预组：HIBD模型大鼠于HIBD造模成功后3h即开始HBO治疗，每天一次，每次1h，疗程4天(Fig．6～7)。 2标本取材：假手术组、HIBD模型组和HBO干预组大鼠分别于造模后18h、24h、48h和96h四个时间点断头取脑(Fig．8)。于4％多聚甲醛中固定24小时后，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。行6μm厚连续切片，以备做病理及免疫组化检测。病理形态学以及免疫组化的检测均以大鼠大脑海马及皮层区为主要观察区域。 3、病理及免疫组化检测：脑组织切片贴附于涂有蛋白甘油的载玻片上，用于常规普通HE染色，观察不同时间干预治疗前、后大鼠脑组织(海马区和皮层区)的病理改变。行免疫组化的脑组织切片贴附于经多聚赖氨酸处理的洁净载玻片上，分别进行caspase-3和caspase-9免疫组化染色，观察caspase-3、caspase-9蛋白的表达程度。 结果： 1、HE染色光学显微镜观察：假手术组大鼠脑切片镜下可见细胞周围轻微水肿，而细胞组织结构基本正常(Fig.9)。HIBD模型组大鼠皮层及海马区神经细胞呈片状变性、坏死和崩解改变，部分神经细胞呈现出典型的凋亡形态学变化(Fig-10)。同时间点HBO干预组大鼠的神经细胞坏死及变性程度较HIBD模型组大鼠明显减轻，凋亡细胞的数量亦显著低于HIBD模型组(P<0,05，Fig.11)。 2、免疫组化检测：caspase-3 caspase-9以阳性细胞染色的积分光密度值(OD)值来表示抗原表达量。 2.1实验各组Caspase-3活性蛋白表达变化：HIBD模型组18h、24h、48h、96h大鼠患侧海马区Caspase-3活性蛋白的表达分别为0.1376±0.0310、0.2113±0.0411、0.1848±0.0314、0.1671±0.0325，明显高于假手术组大鼠(0.1089±0.0023，P值均<0.05)，至24h时间点Caspase-3活性蛋白表达达高峰；HIBD模型组大鼠18h、24h、48h、96h不同时间段患侧皮层区Caspase-3活性蛋白的表达分别为0.1323±0.038、0.2188±0.0367、0.2050±0.0381、0.1818±0.0350，明显高于假手术组(0.1234±0.0027，P值均<0.05)；HBO干预组大鼠海马区和皮层区各相应时间点Caspase-3活性蛋白表达虽高于假手术组，但己明显低于HIBD模型组大鼠(P<0.05)，而且HBO干预组大鼠未出现上述Caspase-3活性蛋白的表达高峰。(不同时间Caspase-3活性蛋白表达见Fig.16～Fig.31)。 2.2实验各组Caspase-9活性蛋白表达变化：HIBD模型组大鼠18h、24h、48h、96h不同时间段患侧海马区Caspase-9活性蛋白的表达分别为0.1467±0.0421，0.1555±0.0450，0.2250±0.0321和0.2230±0.0426，明显高于假手术组大鼠(0.0978±0.0006，P值均<0.05)；HIBD模型组大鼠皮层区Caspase-9活性蛋白的表达在18h、24h、48h、96h时间段分别为0.1316±0.0121、0.1570±0.0126、0.1575±0.01320、0.1486±0.0120，明显高于假手术组大鼠(0.0899±0.0038，P值均<0.05、)；HBO干预组大鼠海马区和皮层区各相应时间点Caspase-9活性蛋白表达均低于HIBD模型组大鼠(p)值均<0.05)，接近假手术组基线水平(不同时间Caspase-9活性蛋白表达见(Fig.32～Fig.47)。 3、HBO干预治疗后各个时间点Caspase-3和Caspase-9活性蛋白表达的动态变化曲线呈一致性趋势(Fig.48～Fig.53)。 结论： 1、HBO可以减轻新生大鼠HlBD模型神经细胞的凋亡。 2、不同时程的HBO干预治疗可明显降低HIBD模型大鼠皮层、海马神经细胞Caspase-3的活性表达。 3、不同时程的HBO干预治疗可降低HIBD模型大鼠皮层、海马神经细胞Caspase-9的表达活性。 4、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达的一致性变化趋势提示：HBO对脑细胞的保护作用可能是通过下调启动型Caspase-9表达，进而抑制下游效应分子Caspase-3的活性表达，最终减少脑细胞的凋亡来完成的。