单碱基编辑技术,包括胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)和腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)是由胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶与单切口的Cas9(Cas9n)融合而成,可在特定的编辑窗口内实现胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)转换或腺嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)转换。相对传统的Cas9介导的同源重组的碱基替代技术,碱基编辑器能产生高效的单碱基转换而不产生DNA双链断裂减少对基因组的损伤。单碱基编辑技术被广泛应用基础研究、基因治疗、动物疾病动物模型构建、药物筛选和农作物遗传育种等领域的研究。碱基编辑器是非常强有力的基因编辑工具,但还存在一些不足,例如CBE只能在限定的大约5个碱基的窗口内编辑,而在靠近PAM区的碱基编辑效率低;此外,目前的碱基编辑器仅能以单一种类的碱基为底物。本研究主要通过对碱基编辑器的改造,构建了一系列新的碱基编辑工具,提高了编辑活性,扩大编辑窗口和产物类型,为碱基编辑工具的优化和应用提供了新的思路。首先,通过CBE融合一个Rad51单链DNA结合蛋白的功能域产生了一系列超高活性CBE(hyCBE)。相对于原来的CBE,在人类细胞系其活性均显著提高并且其工作窗口拓展为靠近PAM区。其中,与eA3A-BE4max相比,hyeA3A-BE4max特异性靶向TC基序中的C,编辑窗口由4-9拓展为4-15,活性最高提高了257倍。通过hyCBEs/CBEs mRNA与sgRNA RNA注射到小鼠的1细胞受精卵胚胎的胞质中靶向基因Dmd靠近PAM区的C,结果显示,hyCBEs比CBE更加高效地产生了杜氏肌营养不良小鼠疾病动物模型。此外,hyeA3A-BE4max更加精确地靶向HBG启动子区引入遗传性胎儿血红蛋白病突变(-117G>A,并显著提高分化了HUDEP-2中的HBG1/2的表达水平。其次,通过腺嘌呤脱氨酶-胞嘧啶脱氨酶-Cas9的融合开发了新型碱基编辑器-A&C-BEmax,既实现了有效编辑两种底物(A或C)的功能,同时对同一等位基因中实现C到T和A到G的同时转换,并产生更多的DNA突变类型。相对于单碱基基因编辑工具,A&C-BEmax的A到G编辑窗口略微缩小,编辑效率有略微下降;C到T的编辑编辑窗口由对应的AID-BE4max的3-13被拓宽为2-17,平均编辑效率最高是AID-BE4max的14倍;同时它还保持较低的RNA脱靶和DNA插入缺失突变。通过靶向HBG1/2启动子区(-113A,-114C,-115C),筛选到不同类型的带有C到T,和同时C到T与A到G突变的HUDEP-2单克隆细胞。分化后,携带有C>T,A>G的HUDEP-2单克隆展示了最高的HBG1/2的表达水平。通过ClinVar数据统计,A&C-BEmax可以通过一条PAM为NGG的sgRNA(或PAM为NG)联合纠正203(或PAM为NG,573)种G到A与T到C临床上致病突变事件。总之,通过我们系统地工程化设计与改造的hyCBE打破了CBE的编辑窗口及编辑效率的技术瓶颈,大大提高其编辑效率及靶向范围的策略,促进CBE在各个领域的广泛应用;A&C-BEmax解除了单碱基编辑器仅能作用于一种底物的限制,提供了一个可以两种碱基作为底物的双功能碱基编辑平台,为基因治疗及靶向基因组多样化提供了新的研究工具。