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目的有效的DNA修复是维持细胞基因组完整及稳定的重要机制,未修复或错误修复的DNA损伤可导致染色体畸变。核酸剪切修复(nucleotide excision repair; NER)是细胞中普遍存在的一种修复方式,能修复紫外线,化学致癌物及内源性氧化应激产物造成的DNA损伤。核酸剪切修复过程十分复杂,有近30个基因参与其中。根据DNA损伤位点识别模式的不同,主要分为两种修复方式：转录耦联修复(transcription-coupled repair; TCR-NER)和全基因组DNA修复(global genome DNA repair; GGR-NER)。一些病毒产物可通过抑制细胞核酸剪切修复能力,增加细胞基因组突变频率,从而引起细胞的恶变。原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma; HCC)是世界上致死率排名第三的恶性肿瘤。在亚洲和非洲地区,慢性乙型肝炎(hepatitis B virus, HBV)感染是引起原发性肝癌的主要原因。异常的DNA损伤修复引起乙型肝炎病毒基因组片段整合入宿主细胞基因组,引起宿主细胞中原癌基因过度激活或抑癌基因失活,是乙型肝炎病毒促进肝癌发生的重要机制之一。乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein; HBx)已证实可通过p53依赖或非p53依赖的方式抑制细胞的核酸剪切修复。MicroRNA (miRNA)是一类长度约21-25个核苷酸、保守的非编码小RNA,通过与mRNA3’端非编码区(3’UTR)的互补位点特异性结合而抑制靶mRNA翻译或降解靶mRNA,是一种起负调控作用的分子。MicroRNA在细胞发育、增殖、分化、凋亡等多种生理病理过程中发挥重要作用。目前,多个参与调节细胞DNA修复途径蛋白的microRNA也已被鉴定出来。为了探索慢性HBV感染是否通过改变细胞中microRNA的表达量而影响肝癌细胞株HepG2核酸剪切修复功能,本研究应用microRNA表达谱芯片鉴定肝癌细胞株2.2.15细胞(HepG2细胞中稳定转染入HBV全基因组)和HepG2细胞中差异表达的microRNAs,筛选出可能作用于细胞核酸剪切修复途径关键蛋白的microRNA,并进一步研究这些microRNA在核酸剪切修复途径的功能及作用机制。方法应用宿主细胞激活实验(Host cell reactivation assay)检测2.2.15细胞与HepG2细胞核酸剪切修复能力的差异。Agilent human miRNA array分析2.2.15细胞与HepG2细胞的miRNA表达谱,通过比较得到2.2.15细胞中异常表达的miRNAs。利用生物信息学技术如miRBase、TargetScan、PicTar等数据库,筛选可能调节细胞核酸剪切修复途径的miRNA,选择出miR-192进一步进行功能研究。TaqMan qRT-PCR验证芯片结果,再通过Luciferase精确靶点实验、SYBR Green定量PCR以及Western blot,确认miR-192作用的靶蛋白。宿主细胞激活实验检测miR-192对HepG2细胞核酸剪切修复能力的影响。结果与HepG2细胞相比,稳定转染入HBV全基因组,表达各种HBV蛋白的2.2.15细胞的核酸剪切修复能力显著降低。通过比较2.2.15细胞与HepG2细胞的miRNA表达谱差异,获得肝癌显著异常表达miRNAs12个(>100 fold change),其中6个miRNAs (miR-194,-429,200b,-215,-146a, and miR-192)表达上调,6个miRNAs (miR-30a*,-99a,-100,-130a,-30a and -125b)表达下调。根据生物信息学技术的预测,miR-192可能靶向作用于三种核酸剪切修复蛋白：XPA、ERCC3和ERCC4。Luciferase精确靶点实验验证ERCC3和ERCC4是miR-192的直接作用靶蛋白,而XPA不受miR-192的直接调控。SYBR Green定量PCR结果显示过表达miR-192后细胞中ERCC3和ERCC4 mRNA水平显著下降,Western blot结果与SYBR Green定量PCR结果一致,过表达miR-192后细胞中ERCC3和ERCC4蛋白水平显著降低,进一步确认ERCC3和ERCC4是miR-192的靶蛋白。最后宿主细胞激活实验验证转染miR-192后,HepG2细胞细胞核酸剪切能力明显降低。结论通过比较2.2.15细胞与HepG2细胞的miRNA表达谱差异可以高效鉴定出慢性HBV感染引起的miRNAs改变。异常表达的miRNA可通过作用其靶蛋白调节细胞核酸剪切修复这一重要生物学过程,从而促进细胞基因组的不稳定进而导致HBV相关性肝癌的发生。本实验从microRNA调控DNA损伤修复的角度阐明HBV促进肝癌发生的机制,提供了一个了解HBV复杂致病机制的新视角。