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衣原体（Chlamydiae）是一种专性胞内病原体,宿主包括人和动物。在衣原体中,沙眼衣原体是重要的人类病原体之一,可引起眼部和生殖器感染。沙眼衣原体株（血清A-C）是传染性失明的主要病因,泌尿生殖系（血清D-K）可引起世界最常见的性传播疾病,而性病淋巴肉芽肿（LGV）株（血清L1-L3）可引起侵袭性泌尿生殖器官或肛门直肠感染。包涵体膜蛋白（Inclusion membrane protein,Incs）存在于包涵体和宿主细胞胞浆的界面上,许多Incs被证明在衣原体-宿主相互作用中起着重要的作用,CT225是已经研究证实的Incs,但其生物学功能还有待进一步研究。在本研究中,通过生物信息学分析发现CT225属于CT223-CT229基因簇,具有转运、运输等功能。利用亲和纯化质谱技术从HeLa细胞中筛选出CT225互相作用的分子并进一步用多种方法进行了鉴定。研究前期进行了CT225互作蛋白的筛选。诱导表达GST-CT225蛋白,用亲和层析法进行纯化,并固定在琼脂糖凝胶上作为诱饵蛋白。HeLa细胞裂解液上清作为猎物蛋白。然后将二者混合孵育,富集可能与GST-CT225发生作用的蛋白。通过LC-MS/MS液质联用质谱技术鉴定富集的蛋白的成分,根据质谱结果的得分筛选出候选蛋白,得分较高的配体分子包括Alpha-actinin、Keratin、Vimentin、Tubulin。根据CT225的生物信息学分析及相关文献提示首先选择Vimentin为候选蛋白。研究后期进行候选蛋白的验证。首先,构建编码候选蛋白的重组质粒,运用免疫共沉淀法检测HeLa细胞内作用。培养HeLa细胞转至6孔板中,待细胞生长到一定数量,用转染试剂转染构建的重组质粒至HeLa细胞内,在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育24 h,用胰蛋白酶收集细胞,用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤后离心收集并冰上裂解细胞,裂解液上清用Western Blot法进行检测,结果显示13kDa和53kDa处有条带,对应Myc-CT225与Flag-VIM。然后,运用GST pull-down技术验证外源性互相作用。使用提前制备的GST-CT225为诱饵蛋白,构建带Flag标签的配体质粒转染至HeLa细胞过表达蛋白,Western Blot法进行检测,发现在39kDa和53kDa位置有两条带,与预期GST-CT225与Flag-VIM分子量相一致。最后,运用亚细胞共定位技术验证空间互相作用。24孔板中放置无菌玻片,培养HeLa细胞至足够数量,转染质粒,在室温下用丙酮固定,血清封闭。用一抗孵育1 h,PBS洗涤后与适当的二抗孵育1 h,再用PBS洗涤。使用DAPI对细胞核进行染色。PBS洗涤后将玻片安置在载玻片上,使用激光扫描显微镜对样品进行分析,观察到Myc-CT225蛋白显示绿色荧光,Flag-VIM蛋白显示红色荧光,两者在三个层面均重叠呈现黄色荧光。综上,本次实验证实了沙眼衣原体包涵体膜蛋白CT225与波形蛋白（Vimentin）存在相互作用,为CT225的生物学功能研究提供了依据,并可能有助于对沙眼衣原体生长发育的分子机制的进一步研究,为进一步阐明其转运机制提供了基础。