环形泰勒虫病是由环形泰勒虫（Theileria annulata）感染所引起的一种蜱传性疾病。该病可经小亚璃眼蜱、残缘璃眼蜱等传播,环形泰勒虫寄生在宿主的血液中,传染性强、发病率高、死亡率高,可导致牛的白细胞增殖。原肌球蛋白受体激酶融合基因（Tropomyosin-receptor kinase fused gene,TFG）是一种主要的原癌基因,其激活后可以调节细胞大小、细胞凋亡及细胞增殖,从而促进肿瘤的发生。为了探讨TFG和环形泰勒虫之间的互作关系,将TFG基因导入pGBKT7的空载体中,利用酵母双杂交技术,从环形泰勒虫cDNA文库中筛选出与TFG互作的蛋白质,从而进一步了解环形泰勒虫裂殖体在调节宿主细胞转化过程中的作用。1.诱饵质粒pGBKT7-TFG的构建参考GenBank中TFG基因的核酸序列设计引物,将目的基因片段TFG插入到pGBKT7载体中,构建重组质粒pGBKT7-TFG。经PCR验证和双酶切双重验证后送测序,经比对后与GenBank中TFG基因的核酸序列一致。2.诱饵质粒pGBKT7-TFG的自激活与毒性鉴定在进行酵母双杂交的选择前,必须对诱饵质粒自激活和毒性进行检验。将构建的pGBKT7-TFG诱饵质粒及pGBKT7空载体分别转化至Y2H Gold酵母细胞中,并将转化子分别涂布在相应的氨基酸缺失的琼脂平板上,根据蓝白斑来判断诱饵质粒是否有自激活性和毒性。实验证明,该诱饵蛋白不具有毒性,而且不存在自激活的可能。3.酵母双杂交筛选与牛TFG互作的环形泰勒虫蛋白将pGBKT7-TFG重组质粒与环形泰勒虫cDNA文库进行混合,并将其导入Y2H Gold酵母感受态的培养基共转化子均匀涂布在DDO/X/A琼脂平板上,其生长的蓝色菌落,挑取部分涂布在QDO/X/A琼脂平板上,传代一次,进行更严格的筛选。对上述获得的蓝色菌落进行酵母质粒的提取,并用文库质粒特异性检测引物p GADT7-F/R进行PCR检测,经过测序鉴定后将未移码的文库质粒与pGBKT7-TFG诱饵质粒共转化至Y2H Gold酵母细胞中,其转化子分别涂布在QDO/X/A琼脂平板上,同时对诱饵质粒和文库蛋白质间的互相作用进行了进一步的研究。结果显示:成功筛选出两个与TFG蛋白相互作用的环形泰勒虫蛋白,分别为TA11965和TA21130。4.CO-IP（免疫共沉淀）验证诱饵蛋白与捕获蛋白的相互作用构建真核表达质粒:TA11965-Flag,TA21130-Flag,TFG-HA。然后用 Western Blotting 技术鉴定单转和共转后HEK293T细胞的表达情况,并用CO-IP验证蛋白互作。实验结果显示:通过酵母双杂交筛选出的环形泰勒虫TA11965蛋白与TFG蛋白可相互作用,而环形泰勒虫TA21130蛋白与TFG蛋白并不互作。5.环形泰勒虫TA11965蛋白序列分析及样品检测利用生物信息学技术对环形泰勒虫TA11965蛋白的结构、结构域、信号肽、跨膜区和抗原表位等进行了分析;并对宁夏固原市泾源县牛场采集的新鲜血液22份进行样品检测,共检测出5份环形泰勒虫阳性样本。综上所述,本实验通过酵母双杂交方法筛选出了一个与牛TFG蛋白相互作用的环形泰勒虫蛋白:TA11965蛋白,并用CO-IP技术验证两者的互作,对我们了解环形泰勒虫裂殖体参与调控宿主细胞转化的分子机制提供了新的线索。