研究背景和目的细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自我结束生命的死亡方式。凋亡是细胞在一系列凋亡诱导因素的作用下,相关的凋亡信号通路被激活,使凋亡调节基因的表达发生改变,进而在Ca2+、Mg2+的参与下激活相关酶而启动的。近年研究发现血管平滑肌细胞(VSMCs)作为构成血管壁的重要成分,其凋亡参与了动脉粥样硬化(AS)及经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄(RS)、高血压等心血管疾病的发生发展过程。VSMCs凋亡是AS和血管成形术后RS的重要病理特征,提示细胞凋亡在AS的发生和发展过程中起到了重要作用。因此,有关VSMCs凋亡的研究已经成为心血管疾病防治研究的热点,深入探讨调控VSMCs凋亡的分子机制具有重要的临床意义,可能成为预防AS进展和PCI术后RS的有效策略。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-activated genes,CREG)是新近发现的一种分泌型糖蛋白,在组织和细胞发育中起重要作用。已有研究表明,CREG蛋白在成熟的组织和细胞中高表达,而在未成熟的细胞如干细胞、人畸胎瘤细胞及未分化的VSMCs中呈低表达,说明CREG对于维持机体细胞和组织的成熟和稳态具有重要的作用。我室前期研究发现CREG过表达能够对抗长期血清饥饿诱导的VSMCs凋亡,而抑制CREG表达后,细胞不耐受去血清培养而发生大量凋亡。本研究以逆转录病毒载体转染CREG过表达及表达抑制的人VSMCs和球囊损伤的人胸廓内动脉(ITA)为研究对象,深入探讨CREG在调控人VSMCs凋亡中的作用及相关分子机制,以期为PCI术后RS的防治提供新的思路和治疗方法。材料和方法我们首先应用逆转录病毒载体,分别将过表达hCREG的pLNCX2-CREG和能够沉默hCREG表达的pSM2-siCREG感染体外培养的人VSMCs。通过抗性药物筛选,获得能够稳定传代的hCREG过表达细胞株(hVSMCs-CREG)和hCREG表达抑制的细胞株(hVSMCs-siCREG)。Western blot鉴定稳定转染细胞株的CREG表达,为进一步探讨CREG调控VSMCs凋亡等生物学行为提供研究平台。应用已构建的CREG过表达和表达抑制的hVSMCs,分别给予凋亡诱导剂斯托斯普林(Staurosporine,STS)和依托泊苷(Etoposide,VP-16)诱导细胞凋亡,采用Western blot、流式细胞计数和TUNEL染色等实验方法检测细胞凋亡情况和相关信号通路变化。并通过细胞瞬时转染和添加有关信号通路抑制剂进一步明确CREG调控细胞凋亡的信号转导通路。在体外实验的基础上,选择患冠心病(CAD)并行冠脉搭桥手术病人的ITA建立球囊损伤模型,在球囊损伤和外源性添加CREG蛋白干预后的不同时间点收取受损动脉段。采用苏木精-曙红染色观察CREG和细胞凋亡标志物cleaved caspase-3变化情况。Western blotting检测CREG、VSMCs分化及凋亡指标和相关信号通路的变化。并给予特异性信号通路抑制剂,进一步明确在血管组织急性损伤的情况下CREG调控细胞凋亡的信号通路。研究结果1、CREG过表达促进VSMCs分化,抑制细胞凋亡逆转录病毒介导CREG基因表达前后三种hVSMCs的形态学发生变化:pLNCX(+)/GFP稳定感染细胞(Ctl cells)呈典型的波峰波谷样生长;CREG过表达细胞(CREG-SN cells)体积变小且更加细长,易于环绕排列生长呈管腔样结构,细胞呈现典型的分化表型生长;CREG表达抑制细胞(CREG-AS cells)体积明显增大,细胞失去极性呈无序样生长。采用Western blot检测CREG-SN、Ctl和CREG-AS三种细胞的CREG表达及分泌情况。发现CREG-SN细胞胞浆中CREG的表达与Ctl细胞无明显差别,而培养上清中表达较Ctl细胞明显增加。CREG-AS细胞与前两组细胞比较,培养上清及胞浆中CREG的表达明显降低(P <0.01)。分别选择不同浓度的STS(50、100、200nmol/L)、VP-16(20、50、100μmol/L)作用于CREG-AS细胞,在不同时间点(0、4、8、12、24 h)收集细胞。Annexin V/PI双染色流式细胞分析显示:不同浓度的STS和VP-16对细胞凋亡均有作用,且其诱导细胞凋亡的效应具有时间和浓度依赖性,即随浓度增加和时间延长,细胞凋亡的效应越明显。其中STS 200nmol/L和VP-16 100μmol/L诱导细胞凋亡的效果最为明显。CREG-SN、Ctl和CREG-AS细胞分别在有效浓度的STS和VP-16诱导下,通过Western blot检测CREG、细胞分化和凋亡指标表达情况。结果发现VSMCs分化标记物SMα-actin和SM MHC的表达趋势与CREG相似,而凋亡标志物cleaved caspase-3及细胞外基质纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)和层粘连蛋白(Laminin-1,LN)与CREG表达趋势相反。同时发现随着药物作用时间延长,在CREG表达抑制组,cleaved caspase-3的增高更明显,SMα-actin和SM MHC的减少更为突出,而CREG过表达明显抑制了细胞凋亡标志物的表达,分化指标表达水平却相对较高。Annexin-V/PI双染流式分析和TUNEL染色也发现CREG过表达明显抑制细胞凋亡。以上结果提示,CREG过表达在维持hVSMCs分化状态的同时,抑制其凋亡。2、CREG通过p38/JNK信号通路调控VSMCs凋亡三种细胞在STS和VP-16作用下,在不同时间点,采用Western blot检测细胞凋亡有关的信号通路,结果发现磷酸化的p38、JNK和Akt均有增高趋势。然后在分别给予信号通路抑制剂SB203580、SP600125和LY294002预处理的基础上,诱导细胞凋亡。通过Annexin-V/PI流式分析,发现p38/JNK信号通路参与调控了VSMCs凋亡,而PI3K?Akt信号通路无明显作用。为进一步明确p38信号通路在CREG调控VSMCs凋亡中的作用,在CREG-AS细胞中瞬时转染p38表达抑制腺病毒质粒和给予特异性p38抑制剂,通过流式分析和Western blot分析进一步明确了p38在细胞凋亡中的作用,同时也发现在p38活化的同时,进一步激活了JNK,两者在调控VSMCs凋亡中存在协同作用。3、在急性损伤的动脉模型中,CREG促进VSMCs分化,同时通过p38/JNK信号通路抑制细胞凋亡体内研究发现,在人ITA球囊损伤修复过程中CREG表达与VSMCs分化状态相关。Western blot结果显示,CREG在AS组织中低度表达,在球囊损伤后7d,CREG表达下降,到第14d和28d表达略升高,始终维持在低表达水平。VSMCs分化标记物SMα-actin和SM MHC的表达趋势与CREG相似,而细胞凋亡标记物cleaved caspase-3与CREG表达趋势相反。在给予CREG蛋白干预后血管中CREG维持在高表达水平,SMα-actin和SM MHC也明显增加并维持在高度表达水平,而cleaved caspase-3表达明显下降。免疫组织化学结果显示cleaved caspase-3在球囊损伤后28d明显增高,而在给予CREG蛋白干预后,其表达水平明显下降。HE染色也显示在球囊损伤后28d新生内膜明显增厚,而CREG蛋白干预后,明显抑制了损伤后新生内膜的形成。以上结果提示在血管组织急性损伤修复过程中CREG可能在促进VSMCs分化,抑制细胞凋亡方面发挥重要作用。Western blot也显示,在急性损伤后,尽管总的p38、JNK和Akt表达没有明显改变,但在损伤后14d磷酸化的p38、JNK和Akt表达明显增加。在外源性添加不同浓度的CREG蛋白干预后,p38、JNK和Akt活化形式的表达量明显减低。与此同时,分别给予p38、JNK和Akt信号通路抑制剂,结果显示在p38抑制剂组中磷酸化的p38和JNK表达均明显下降,在JNK抑制剂组中磷酸化形式的JNK明显减少,而p38的活化亦有所减低。同时发现p38和JNK抑制剂组中细胞凋亡指标cleaved caspase-3表达明显减少,而Akt抑制剂组无明显改变。进一步证实了p38和JNK信号通路共同参与调控急性血管损伤后的细胞凋亡,p38与JNK信号转导通路之间具有协同作用。结论体外和离体实验均证实了CREG通过p38/JNK丝裂原活化蛋白激酶信号通路调控血管平滑肌细胞凋亡,进一步阐明CREG对于临床PCI术后RS的预防可能有重要的价值。