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多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有两个或两个以上双键且碳链长18-22个碳原子的直链脂肪酸,可以分为n-6和n-3两大系列,包括亚油酸(Linoleic acid,LA,18:2n-6),二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid,EPA,20:5n-3),亚麻酸(α-linolenic acid,ALA,18:3n-3)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid,DHA,22:6n-3)等。PUFAs由于在食品,医药,保健品等[2,3]领域的重要作用,近年来逐渐受到国内外学者的广泛关注。在生物体内,Δ 12-脂肪酸脱氢酶(Δ 12-fatty acid desaturase,D12D)催化油酸 OA(Oleic acid,18:ln-9)合成LA是真核生物中PUFAs合成的关键步骤。为了研究膜脂中PUFAs合成抑制对酵母低温生长适应性的影响,本研究以红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为研究对象,通过其Δ1-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、表达和基因敲除菌株分析来研究细胞膜膜脂中PUFAs组成变化与酵母形态、理化性质的关系,探讨PUFAs对红冬孢酵母YM25235低温生长的影响。本研究通过揭示酵母PUFAs合成与低温适应性的关系,为最终阐明红冬孢酵母YM25235低温适应性机制的研究提供参考,有助于探讨通过基因工程手段构建PUFAs高产菌株的可能,为进一步的应用打下基础。地球生物圈75%以上的环境温度常年低于5℃,这些生境中的微生物在长期进化过程中从细胞到分子水平形成一套独特的低温环境适应机制,而通过增加细胞膜膜脂中PUFAs含量来维持低温条件下最佳的细胞膜流动性是其中的一种[1,5,6]。然而,目前仍不清楚真核生物,特别是酵母如何通过PUFAs的合成调节来提高细胞膜的流动性并适应低温环境的机制。本研究通过PUFAs合成抑制对酵母低温生长适应性的影响来探讨PUFAs与微生物低温适应性的关系,为相关的基础和应用开发研究提供参考。本研究根据转录组测序结果获得的红冬孢酵母Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列设计基因特异性引物,通过PCR扩增获得到全长为1341bp的cDNA序列,序列分析结果表明该序列具有一个完整开放阅读框,编码446个氨基酸,蛋白质的大小为50.6KD。与报道的Δ1-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构。为了验证其功能,把目的基因亚克隆到表达载体PYES3.0/CT,构建重组表达载体pY3RKD 12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,该序列所编码的蛋白质具有Δ12-脂肪酸脱氢酶活性,能将油酸转化为亚油酸,亚油酸的含量占酵母总脂肪酸的3.76%。因此我们获得cDNA序列是一个新的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因,该基因的NCBI Genbank编号为KJ502671。本研究成功构建基因敲除载体pRH-D 12D,通过醋酸锂转化法将重组质粒pRH-D 12转入YM25235感受态细胞中,并在潮霉素B浓度为150mg/L的YPD选择培养基上筛选转化子,通过PCR鉴定获得1个Δ12-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株RKD12D-5,气相色谱分析结果显示:该突变株亚油酸、α-亚麻酸特征峰明显减弱,相应地硬脂酸产量显著增加。低温条件下生长曲线测定及平板培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株YM25235相比均有显著改变。以上结果说明PUFAs合成受到抑制不利于YM25235低温下生长。此外,脱氢酶基因的表达可能受到胞内脂肪酸组成变化而引发的反馈调节。本文首次通过基因敲除的方法对红冬孢酵母YM25235 Δ12-脂肪酸脱氢酶基因的表达调控机制进行了探索,为深入了解产油菌株体内脱氢酶基因表达及PUFAs合成对外界信号的应答机制提供了材料,也对利用微生物发酵技术和转基因技术生产PUFAs具有指导意义。