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研究背景和目的我国是一个肝病大国,慢性肝病的发生率相对较高,而肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化的必经病理改变。肝纤维化具有可逆性,因此,尽早地阻断和延缓肝纤维化的发生和发展,在一定程度上能有效地控制肝硬化的形成。探讨肝纤维化的发生发展机制,寻找有效的抗肝纤维化药物是关系人类生命健康的重大课题,具有重要而深远的临床意义和社会价值。肝纤维化(hepaticfibrosis, HF)是指肝细胞发生坏死时,活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞增多,肝脏中胶原蛋白等细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)的增生与降解失衡,导致肝脏内纤维结缔组织大量沉积的病理改变。肝纤维化是由多种细胞因子、生长因子和氧化应激等一系列复杂作用的结果。研究发现,在肝损伤过程中,肝内三种细胞即肝细胞、胆管上皮细胞和静息性肝星状细胞(Q-HSC)均可受各种细胞因子的调控发生表型转变,获得肌成纤维细胞(myofibroblast, MFb)特征,表明肝纤维化过程中伴有上皮-间质转换。上皮-间质转换(epithelial mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞在形态、结构、粘附及迁移能力等方面获得间质细胞特性的过程。其主要表现为：上皮细胞表型基因如E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达下调；间质细胞表型基因如波形蛋白(vimentin)表达上调；间质细胞功能基因如Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)表达增强等。肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system, RAS)是近年来肝纤维化领域的又一研究热点。研究表明,肝内ACE-AngⅡ-AT1R轴与肝纤维化的形成有着密切的联系。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是RAS的重要效应分子,它通过激活肝星状细胞、汇管区的肌成纤维细胞及骨髓源性间质细胞等诸多致肝纤维化的潜力细胞,进而促进肝纤维化的发生和发展。本课题组前期研究发现,AngⅡ可以诱导人肝细胞系(HL-7702)发生上皮-间质转换。因此,本论文通过体外实验进一步观察AngⅡ是否也可以诱导原代大鼠肝细胞发生上皮-间质转换；同时观察AngⅡ作用于大鼠肝细胞系(BRL-3A)后,细胞迁移能力是否发生改变。随着人们对RAS认识的不断深化,逐渐发现了RAS的许多新的组分,如血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素1-7(Ang(1-7))、Ang(1-7)的受体Mas等,它们构成的ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴,成为RAS的另一重要分支,对ACE-AngⅡ-AT1R轴具有显著的抑制作用。Ang(1-7)在体内外能与AT1R竞争性结合,拮抗AngⅡ的活性,发挥抗纤维化的作用。因此,本论文通过体内和体外实验,观察ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴是否可以抑制AngⅡ的作用,抑制肝细胞上皮-间质转换的发生,发挥抗肝纤维化作用。方法一、血管紧张素转换酶2对血管紧张素Ⅱ诱导的肝细胞上皮-间质转换的体外实验1.血管紧张素Ⅱ诱导大鼠肝细胞发生上皮-间质转换分离培养原代大鼠肝细胞,予不同浓度的AngⅡ刺激原代大鼠肝细胞48h后,免疫蛋白质印迹(Western Blot)法检测各组中collagen、vimentin、E-cadherin蛋白表达水平的变化；分组为：对照组、10-9mmol/L AngⅡ处理组、10-7mmol/L AngⅡ处理组,实验重复3次。分离培养原代大鼠肝细胞,予10-7mol/L AngⅡ分别于24小时、48小时、72小时不同时间点处理原代大鼠肝细胞,免疫蛋白质印迹(Western Blot)法检测各组中collagen、vimentin、E-cadherin蛋白表达水平的变化；分组为：24小时对照组、AngⅡ处理24小时组、48小时对照组、AngⅡ处理48小时组、72小时对照组、AngⅡ处理72小时组,实验重复3次。AngⅡ刺激大鼠肝细胞系(BRL-3A)48小时后,Transwell侵袭实验法观察细胞迁移能力的改变；分组为：对照组、AngⅡ刺激组,实验重复3次。2.血管紧张素1-7抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肝细胞上皮-间质转换分离培养原代大鼠肝细胞,予不同刺激处理原代大鼠肝细胞,免疫蛋白质印迹(Western Blot)法检测各组中vimentin、E-cadherin蛋白表达水平的变化；分组为：对照组、AngⅡ刺激组、Ang(1-7)刺激组、AngⅡ+Ang(1-7)处理组、AngⅡ+Ang(1-7)+A779处理组,实验重复3次。3.血管紧张素转换酶2抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肝细胞上皮-间质转换构建lentiACE2慢病毒载体,并转染大鼠肝细胞系(BRL-3A),免疫蛋白质印迹(Western Blot)法检测各组中collagen、vimentin、E-cadherin、albumin蛋白表达水平的变化；分组为：对照组、lentiGFP组、lentiACE2组、lentiACE2+A779处理组,实验重复3次。构建lentiACE2’慢病毒载体,并转染大鼠肝细胞系(BRL-3A),予不同刺激处理后,免疫蛋白质印迹(Western Blot)法检测各组中vimentin、albumin蛋白表达水平的变化；分组为：对照组、lentiGFP组、lentiACE2组、lentiGFP+AngⅡ处理组、lentiACE2+AngⅡ处理组、lentiACE2+AngⅡ+A779处理组、AngⅡ刺激组,实验重复3次。构建lentiACE2慢病毒载体,并转染大鼠肝细胞系(BRL-3A),予不同刺激处理后,Transwell侵袭实验法观察细胞迁移能力的改变；分组为：对照组、lentiGFP组、lentiACE2组、lentiGFP+AngⅡ处理组、lentiACE2+AngII处理组、lentiACE2+AngII+A779处理组、AngⅡ刺激组,实验重复3次。二、血管紧张素转换酶2对血管紧张素Ⅱ诱导的肝细胞上皮-间质转换的体内实验1. Wistar大鼠构建假手术组大鼠模型(sham)、胆管结扎肝纤维化组大鼠模型(BDL)及BDL基础上Ang(1-7)治疗组模型(BDL+Ang(1-7)),对肝组织进行ISHAK及METAVIR肝纤维化评分和Masson染色。2.将人肝组织冰冻切片进行albumin+collagen免疫荧光双染；分组为：正常组、肝纤维化组,进一步观察肝细胞是否发生上皮-间质转换。结果一、血管紧张素转换酶2对血管紧张素Ⅱ诱导的肝细胞上皮-间质转换的体外实验1.血管紧张素Ⅱ可诱导大鼠肝细胞发生上皮-间质转换不同浓度的AngⅡ刺激原代大鼠肝细胞48h,与对照组相比,10-9mmol/L AngⅡ组和10-7mmol/L AngⅡ组肝细胞中E-cadherin蛋白表达减少(P<0.05),collagen、vimentin蛋白表达增多(P<0.05)；与10-9mmol/L AngⅡ组相比,10-7mmol/L AngⅡ组肝细胞中E-cadherin蛋白表达减少(P<0.05); collagen、 vimentin蛋白表达增多(P<0.05)。不同时间点10-7mmol/L AngⅡ处理原代大鼠肝细胞,培养24小时,与对照组相比,AngⅡ刺激组原代大鼠肝细胞间质标志collagen、 vimentin蛋白增加不明显,无统计学意义,上皮标志E-cadherin蛋白表达减少(P<0.05),差异有统计学意义；培养48小时,AngⅡ刺激组与对照组相比,collagen、vimentin蛋白明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,E-cadherin蛋白表达减少(P<0.05),差异有统计学意义；培养72小时,AngⅡ刺激组与对照组相比,collagen蛋白增加不明显,无统计学意义,vimentin蛋白明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,E-cadherin蛋白表达减少(P<0.05),差异有统计学意义。AngⅡ刺激大鼠肝细胞系(BRL-3A)48小时后,AngⅡ刺激组迁移细胞数较对照组迁移细胞数明显增多(P<0.05),差异有统计学意义。2.血管紧张素1-7可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肝细胞上皮-间质转换分离培养原代大鼠肝细胞,予不同刺激处理48h后,与对照组相比,AngⅡ刺激组的E-cadherin蛋白表达减少(P<0.05), vimentin蛋白表达增加(P<0.05),差异有统计学意义；与AngⅡ组相比,AngⅡ+Ang(1-7)处理组E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05), vimentin蛋白表达减少(P<0.05),差异有统计学意义；与AngⅡ+Ang(1-7)处理组相比,AngⅡ+Ang(1-7)+A779处理组E-cadherin蛋白表达减少(P<0.05), vimentin蛋白表达增加(P<0.05),差异有统计学意义。3.血管紧张素转换酶2可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肝细胞上皮-间质转换本实验成功构建lentiACE2慢病毒载体,并转染进入大鼠肝细胞系(BRL-3A)中。与对照组相比,转染ACE2慢病毒的大鼠肝细胞albumin和上皮标志E-cadherin蛋白表达明显增加(P<0.05),间质标志collagen、vimentin蛋白表达降低(P<0.05),差异有统计学意义；AngⅡ干预慢病毒ACE2转染的BRL-3A细胞,析因分析结果示：病毒转染及AngⅡ两因素间存在交互效应,ACE2转染组能显著抑制AngⅡ引起的albumin表达下降、vimentin表达上调。二、血管紧张素转换酶2对血管紧张素Ⅱ诱导的肝细胞上皮-间质转换的体内实验1.通过对Sham组、BDL组及BDL+Ang(1-7)组大鼠肝组织Masson染色进行ISHAK及METAVIR肝纤维化评分发现,BDL组模型组胶原纤维染色及肝纤维化评分显著高于Sham组?(P=0.000),差异有统计学意义；而BDL+Ang(1-7)组胶原纤维染色及肝纤维化评分显著低于BDL模型组(P=0.000),差异有统计学意义。但两者均较Sham组高。2.人肝组织冰冻切片albumin+collagen免疫荧光双染结果显示：正常组中同时表达albumin(绿色)和collagen(红色)的细胞较少,而肝纤维化组中同时表达albumin(绿色)和collagen(红色)的细胞则明显增多。表明这些细胞曾经是肝细胞(表达albumin),经过纤维化后转变为间质细胞(表达collagen),也就是说发生EMT改变的细胞确实是部分肝细胞。结论1. AngⅡ可诱导肝细胞发生上皮-间质转换。2.ACE2-Ang(1-7)-Mas轴可抑制AngⅡ的作用,抑制肝细胞上皮-间质转换。