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目的:心肌梗塞后及时恢复缺血区的血供(再灌注)是挽救缺血心肌的必需步骤,但该过程中伴随着严重再灌注损伤的发生,再灌注初期活性氧(ROS)的大量释放被认为是造成这一损伤的主要因素之一,然而,ROS同时也作为启动者介导了缺血预处理(IPC)和后处理(IPoC)等措施对抗心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的保护作用。为了解释ROS这种相互矛盾的双重作用,研究者提出了一种假设,即低浓度ROS作为第二信使参与了心肌保护作用,而高浓度ROS则导致细胞损伤,但如何界定ROS起损伤或保护作用浓度界限目前尚无明确的研究结论;此外,该理论无法完美解释众多应用抗氧化剂的临床实验并没有显著心肌保护作用的事实。间歇性低压低氧(IHH)被证明具有独特的对抗心肌缺血/再灌注损伤的保护作用,主要体现在改善心肌舒缩功能、抗心律失常及减轻心肌梗死等。与IPC和IPoC相比,IHH具有保护效应持续时间长、副作用少及非介入性操作等优点。目前关于IHH心肌保护作用分子机制的研究主要集中在:①改善能量代谢;②神经体液调节;③维持钙稳态;④减轻氧化应激;⑤激活促存活信号通路、抑制凋亡相关信号通路等,但其多靶点、多效应器的心肌保护作用是如何协调的,主导的调控机制是什么尚不清楚,对其机制的了解也远不如对IPC和IPoC心肌保护作用机制的认识。针对这些问题,为了进一步从阐明其作用机制、寻找可能的缺血性心脏病治疗靶点,我们采用了蛋白质组学的技术研究了IHH对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤前后蛋白表达谱的影响,探讨了线粒体在IHH心肌保护中的重要作用,进而利用IHH模型研究了再灌注初期ROS释放在心肌缺血/再灌注损伤及其保护中的不同作用方式。
方法:雄性SD大鼠随机分为常氧组(normoxia)和IHH组,IHH组于低压氧舱接受28天相当于5000m海拔高度的低压低氧处理,每天4h。处理结束后,分离normoxia组和IHH组大鼠心脏,利用Langendorff灌流模型,进行30 min缺血继之45 min再灌注,观察记录心功能指标的变化。收取缺血前和再灌注后左心室心肌组织,利用二维电泳和MALDI-TOF-TOF质谱技术分析并确认差异表达的蛋白。分离缺血前和再灌注后活体心肌组织的线粒体,检测线粒体膜电位、耗氧率、ROS释放量及三磷酸腺苷(ATP)合成酶活性。利用不同浓度过氧化氢(H202)预处理和后处理模型验证ROS诱导心肌保护作用的浓度依赖关系,并通过在再灌注初期加入不同抗氧化剂研究该阶段ROS释放在IHH心肌保护中的作用。为了研究IHH对缺血/再灌注过程中ROS释放的影响,利用分离心肌细胞模拟缺血(20 min)/再灌注(30 min)模型,用DCF荧光染料实时监测ROS的释放。进一步利用Western blot方法研究ROS在心肌缺血/再灌注损伤及其保护中对保护性信号通路及内质网应激(ER stress)通路不同的浓度依赖的调控模式,并利用特异的抑制剂分析蛋白激酶B(PKB/Akt)与蛋白激酶C(PKC)-ε在H202PC、PoC及IHH心肌保护中的重要作用及其调控方式。
结果:IHH显著改善了大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤后左心室收缩舒张功能及冠脉流量的恢复。蛋白质组学分析结果显示,IHH改变了大鼠心肌缺血/再灌注损伤前后的蛋白表达模式,其中对能量代谢相关蛋白表达的影响最为明显。进一步的实验证实IHH改善了心肌缺血/再灌注损伤后线粒体的膜电位、耗氧率、ATP合成酶活性及心肌ATP含量的降低;ATP合成酶特异的抑制剂寡霉素(Oligomycin)完全消除了IHH对心脏功能及线粒体活性的保护作用。此外,H202PC和PoC均浓度依赖地改善了缺血/再灌注后左心室功能的恢复,该保护效应只在中等浓度(10-100μmol/L)时出现,低浓度(1-3μmol/L)及高浓度(1 mmol/Lol/L)H202限制了心脏功能的恢复,Western blot结果显示,中等浓度H202PC和PoC显著增加了心肌缺血/再灌注后糖原合成酶激酶(GSK)3-β的磷酸化,减轻了热休克蛋白(HSP)27的表达下降,而低浓度时无明显影响。与之相反,低浓度H202(1-3μtmol/L) PC和PoC已显著上调了心肌缺血/再灌注后ER stress相关蛋白的表达,该效应在3μmol/L H202处理下达到平台期,并不随其浓度增高而增强。提示中等浓度H202对保护性信号通路的激活可能限制了ER stress的进一步加重。进而,利用IHH模型研究了再灌注初期ROS的释放在心肌保护中的作用。结果表明,IHH显著增加了心肌细胞再灌注初期ROS的释放,并且IHH与20μmol/L H202 PoC的心肌保护作用没有叠加效应,其改善心肌缺血/再灌注损伤后左心室功能恢复、增加GSK3-β的磷酸化、减轻HSP27的表达下降等保护作用均被再灌注初期应用的ROS清除剂消除。同时,ROS清除剂也消除了IHH增强心肌缺血/再灌注损伤后Akt和PKCε磷酸化的作用;Akt的抑制剂Wortmannin和PKC-ε的抑制剂εVl-2均消除了H202PC、PoC及IHH的心肌保护作用;并消除了对方在IHH组磷酸化的增强。
结论:以上结果表明,IHH显著地改善了大鼠心脏缺血/再灌注损伤后收缩舒张功能的恢复、心肌细胞线粒体的功能及能量代谢状态,ATP合成酶在IHH心肌保护中可能起着重要的作用。再灌注初期ROS释放的增加可能是IHH对抗缺血/再灌注损伤心肌保护作用的重要机制。研究结果还揭示,ROS所诱导的心肌保护作用存在浓度阈值,达到该阈值的ROS能够有效激活Akt和PKCε等保护性信号通路,进而产生心肌保护作用;Akt与PKCc能够形成正反馈的激活环路,并协同介导了ROS依赖的心肌保护作用,这可能是ROS激发心肌保护作用浓度阈值的内在机制。而正常心肌再灌注初期所释放的ROS并不是过量的爆发,其浓度低于可激发心肌保护作用的阈值,但仍可造成心肌细胞内质网应激,进而导致损伤。本研究揭示了IHH心肌保护的线粒体和ROS机制,为解释ROS矛盾作用的机理提供了新的视角,并为缺血性心脏病的临床治疗提供了新的实验证据。