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目前中国耕地污染严重,食品安全受到极大地威胁。化肥和农药的使用,在一定程度上保证了农作物的生产。然而化肥和农药却是农业非点源污染的第一位污染物,在非点源污染中占据很大比例。研发和应用广谱、高效、环保的新型制剂,减少化肥、农药使用量,是近年来植物生长调节剂和肥料研发领域的重点和热点。因此,为减少化肥和农药的使用,开发和应用新型环境友好制剂十分必要。 钛离子对植物具有多种作用,能显著提高植物种子的发芽率,促进根系发达,提高作物肥料的利用率,提高植物体内叶绿素含量,促进植物进行光合作用,进一步显著增加作物产量,从而降低农药和化肥的使用量。然而,钛离子对植物的这些作用机制尚不清楚。因此,探究钛离子对植物的作用机理,是本研究探讨的科学问题。研究结果将为进一步有效应用钛离子制剂提供理论依据。 本论文以紫花苜蓿(Medicago sativa)和番茄(Solanum lycopersicum)为材料,以新型环境友好的抗水解稳定离子钛(Anti-hydrolyze stabilized ionic titanium,ASIT)为钛离子制剂,研究钛离子对植物生长及基因表达的影响。通过测定植株的根系,以及幼苗过氧化物酶(Peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)酶活性,研究钛离子对植物的生理和生长的作用。并进行田间试验观察钛离子对番茄生长和抗病性的影响。进一步利用RNA-Seq技术,在Illumina平台进行高通量测序,在转录水平上检测钛离子对基因表达的影响,并通过荧光定量PCR对测序结果进行检测验证。获得以下结果: 一、钛离子促进植株的生长和提高抗病能力 紫花苜蓿和番茄种子钛离子(4或8mg/L)和清水分别浸种后播种,观察植株生长。结果显示,与对照相比,处理组植株根系发达,根更长、须根更多、根系更密,幼苗更健壮。浓度为8mg/L处理的效果更好。结果表明,钛离子显著促进苜蓿和番茄植株的生长。 番茄种子分别用0(对照组)、8mg/L钛离子(处理组)浸种24hr后播种,幼苗期间隔3周分别喷施(4mg/L)2次后,全生育期观察。结果显示,钛离子处理组番茄生长良好,根系发达,几乎未感染疾病。对照感染严重的脐腐病,几乎绝收。脐腐病通常是缺钙、缺硼造成。结果表明,钛离子能显著促进根系发达,提高植株对养分的吸收利用,提高番茄的抗病能力。 二、钛离子提高植株酶促防御系统酶活性 钛离子(8mg/L)溶液浸种苜蓿和番茄,萌发后检测钛离子对植株SOD、POD、CAT酶活性的影响。与对照相比,钛离子处理组POD、CAT、SOD活性均显著提高。结果表明,钛离子能促进酶促防御系统酶活性,提高植株对逆境的抗性。 三、钛离子影响紫花苜蓿和番茄基因表达 高通量RNA-Seq测序,比较转录组分析,研究钛离子对植株基因表达的影响。钛离子溶液(0,8mg/L)浸种紫花苜蓿24hr后萌发,3天后取整株进行测序,研究钛离子对植株基因表达的影响。与同属已经测序的蒺藜苜蓿进行比对,紫花苜蓿与之匹配率较低,因此进行无参考基因组分析。结果显示,测序共获得129,001,482条原始数据(Raw reads),原始测序数据经过滤后得到高质量Clean reads127,178,765条。de novo拼接共获得大于200bp的转录本327,131条,大于200bp的非冗余unigene共200,921个。对unigene进行7大数据库的基因功能注释,至少能成功注释到一个数据库的unigene共有181,870(90.51%)条。差异表达分析表明,与对照相比,8mg/L钛离子处理引起大量基因表达发生变化,668个差异表达的基因中313个上调表达,355个下调表达。GO和KEGG注释结果显示大量光合作用、种子发育相关类编码基因上调表达。 用钛离子溶液(0,8mg/L)喷施番茄叶面,研究钛离子对番茄叶片基因表达的影响,在转录水平上研究钛离子作用的分子机理。结果显示,原始数据经过滤,每个样品的Clean reads都在42,724,406reads以上。与番茄参考基因组进行比对,共获得24,403个基因注释结果。差异表达分析表明,与对照相比,8mg/L钛离子处理引起大量基因表达发生变化,1145个差异表达的基因中818个上调表达,327个下调表达。GO和KEGG注释结果显示大量DNA复制、核糖体类、酶促防御系统酶和抗病相关等编码基因上调表达,下调的基因主要有天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶等基因。 因此,苜蓿和番茄在经过钛离子溶液处理后,对植株的基因表达产生影响,大量与生长和抗性相关的基因上调表达。 四、实时荧光定量PCR证实测序结果的可靠性 为了确认Illumina RNA-Seq结果的准确性和可重复性,分别挑选苜蓿和番茄26个差异显著表达基因进行实时荧光定量PCR鉴定测序结果,这些基因包括病程相关、氧化还原、光合作用相关等,包括上调和下调的unigene。qRT-PCR结果和RNA-Seq结果一致率达到70%以上,说明转录组定量结果可靠。 结论和推论: 钛离子能够影响紫花苜蓿和番茄大量基因表达,上调许多基因的表达,如核糖体蛋白、叶绿素A/B结合蛋白、脂氧合酶、铁氧还蛋白、酶促防御系统酶和抗病相关等编码基因等基因;显著促进植株根系发达,有利于根系对土壤中养分的吸收,促进植株生长,提高植株的抗逆能力,可减少化肥和农药的施用量,提高作物的产量和品质。 钛离子在光作用下,会发生能级跳跃,催化氧化还原反应。推测这种弱胁迫作用,作为一种信号刺激植物产生应答,引起基因表达发生变化,促使植物体内产生各种生理生化反应,从而促进植物生长、促进植物根系发达,提高作物对逆境的耐受力。本研究为揭示钛离子对植物的作用机理打下基础,为进一步钛离子制剂在农业生产中的应用提供指导。