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光是绿色植物进行光合作用的重要能源,植物的生命活动离不开充足的光照。随着光强的增加,叶片的光合能力越来越强,达到饱和。然而,当光强继续增强,光合器官吸收的光能将超过光合作用所能利用的量,叶片吸收光能过多,不能及时有效地加以利用或耗散时,植物就会遭受强光胁迫,引起光合能力降低。在强光下,植物发展出了一系列的生理和生化方面的光保护机制,如:光呼吸、梅勒反应、叶绿体类囊体膜蛋白的磷酸化,以及叶黄素循环等。直射的强光可能会使植物细胞中的叶绿体受到损伤。在进化的过程中,植物形成了一套机制感受入射光的强度,根据入射光的强度调节叶绿体的运动。在弱光下,叶绿体沿着入射光的方向聚集,在细胞的平周壁方向排列,称为积聚运动(accumulation movement)。通常认为,叶绿体发生积聚运动是为了最大限度的获得光源进行光合作用。在强光下,叶绿体就避开强光,沿入射光反方向运动并在细胞的垂周壁方向排列,这就称为避光运动(avoidance movement)。 过氧化氢是植物应对外界环境刺激而产生的活性氧中的最常见的一种,许多文献报道其可以作为信号分子传递植物对外界应激产生的信号从而参与到植物众多的生长发育和胁迫应激应答反应中。为了研究过氧化氢是否参与高蓝光诱导的叶绿体避光运动,我们通过利用现代光学手段(荧光光谱和激光共聚焦显微技术)结合新型的活性氧荧光分子探针2’,7’-二氯二氢荧光素二乙脂(dichlorofluorescin diacetate,H2DCF-DA),以拟南芥为研究对象,在位的观测蓝光诱导下叶片中活性氧(ROS)的生成。研究发现,在高蓝光照射处理叶表皮条后,可以在拟南芥叶表皮条中观察到DCF荧光的上升,这说明在蓝光照射下在叶肉细胞中产生和积累了大量的过氧化氢。利用激光共聚焦扫描显微技术,测定了单个叶肉细胞在高辐照蓝光照射30分钟后DCF荧光的变化,显示出有大量的ROS在叶绿体上产生,同样在没有叶绿体定位的细胞膜的位置,也可以观察到DCF荧光。这说明叶肉细胞在高蓝光照射下诱导生成的过氧化氢主要来源于叶绿体和细胞膜两个区域。利用光合电子传递链阻断剂DCMU和NADPH氧化酶专一性抑制剂DPI处理叶片后,发现两者都能分别的部分抑制高蓝光诱导的过氧化氢的产生。这进一步的说明了高蓝光诱导过氧化氢的主要来源是叶绿体的光合电子传递链和细胞膜上的NADPH氧化酶。进一步的实验表明,外源的过氧化氢可以加速启动并增强高蓝光诱导的叶绿体避光运动,而这种促进作用在浓度范围0-10-4M内是浓度依赖性的。在大于10-4M的浓度下,外源的过氧化氢表现为细胞毒性。并且高蓝光诱导植物细胞大量的过氧化氢的产生以及高蓝光诱导的叶绿体避光运动可以被过氧化氢酶及其他抗氧化剂所清除。这说明高蓝光诱导了植物细胞叶绿体和细胞膜处大量产生的过氧化氢作为信号分子参与并且正向调节了高蓝光诱导的叶绿体避光运动。 在蓝光诱导的叶绿体运动信号转导过程中,首先是通过蓝光诱导向光素的自我磷酸化将光信号转化为化学信号,从而通过蛋白磷酸化的形式在细胞内传递的。蛋白磷酸酶是一种高等植物中广泛存在的酶类,能够将对应底物去磷酸化的酶,即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去,并生成磷酸根离子和自由的羟基。蛋白磷酸酶2A是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族中的一种,参与调节了植物生长发育生理的多个过程。为了研究蛋白磷酸酶2A是否参与了高蓝光诱导的叶绿体避光运动,我们首先检测了蛋白磷酸酶2A缺失突变体中响应蓝光的叶绿体运动与野生型的区别。数据显示,蛋白磷酸酶2A可能作为一种正向的调节因子参与了向光素2介导的叶绿体避光运动,而不参与向光素1介导的叶绿体积聚运动。用冈田酸和斑蝥素(蛋白磷酸酶1和2A的专一性抑制剂)处理叶片后发现,在一定的浓度范围内(冈田酸为10-1-10-3μM,斑蝥素为1-10-3μM),蛋白磷酸酶抑制剂对叶绿体避光运动的抑制作用是浓度依赖的。进一步的研究表明,蛋白磷酸酶2A不是通过调节植物向光素的磷酸化状态来调控高蓝光诱导的叶绿体避光运动,而是通过去磷酸化并激活微丝解聚因子(ADF/cofilin)从而调控了与叶绿体运动相关的微丝骨架动力学改变。冈田酸处理叶肉细胞抑制了细胞内微丝骨架的构型改变同样证实了这一观点。实验表明,蛋白磷酸酶2A作为中间因子参与并调节了向光素2介导的叶绿体运动。同时我们发现蛋白磷酸酶2A是通过调节微丝解聚因子的活性,从而调节了蓝光诱导的细胞骨架构型的重排,从而调控叶绿体避光运动。 本研究通过对高辐照蓝光下叶绿体避光运动的机理研究,探讨了高辐照蓝光诱导下产生的ROS对叶绿体运动机制调节作用,以及蛋白磷酸酶调节的向光素磷酸化和微丝运动对叶绿体避光运动的影响,为蓝光诱导的通过向光素介导的叶绿体运动其信号转导链上中间环节的明确解析做基础。也为筛选出最大限度利用光能,并能最大限度降低强光伤害的突变体植株提高作物产量提供了一定的理论和实验基础。