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目的:1.在“经络理论”和“从脾论治思路”的指导下,以干预措施隔日限食和研究对象脊髓损伤为载体,研究辟谷理念在督脉受损病证中的应用,为其应用范围的拓展提供实验证据。2.采用医用脑血管临时动脉瘤夹建立大鼠脊髓钳夹损伤模型,采用隔日限食进行干预,观察隔日限食对脊髓损伤大鼠脊髓组织病理变化和运动功能恢复的影响,并初步探索其对脊髓损伤急性期NF-κB信号通路及炎性相关细胞因子表达的影响,为今后继续研究隔日限食在促进脊髓损伤恢复过程中的作用机制提供实验依据,奠定实验基础。方法:1.动物来源及模型制备:选用购自成都达硕生物科技有限公司的实验用SD成年大鼠(实验动物质量合格证号:SCXK(川)2015-030),雌性,SPF级,体重280-310g。采用医用脑血管临时动脉瘤夹(夹闭力70g)制备T10脊髓钳夹损伤大鼠模型。2.实验分组:实验中大鼠随机分为如下四组:A组:脊髓损伤+隔日限食组,B组:脊髓损伤组,C组:假手术+隔日限食组,D组:假手术组。假手术组仅接受椎板切除术。隔日限食组大鼠术后立即开始禁食24小时(仅供饮水,下同),之后给予24小时常规食物,然后再给予禁食24小时,如此反复直至试验结束。非隔日限食组大鼠自由进食、饮水。3.将36只SD大鼠随机分为A、B、C、D四组,每组9只,观察隔日限食对脊髓钳夹损伤模型大鼠脊髓组织病理变化和运动功能恢复的影响,实验周期为12周:观察各组大鼠术后进食量与体重变化;分别于术前1天及术后1天、术后第1、2、4、6、8、10、12周,采用BBB评分评估大鼠后肢运动功能的恢复情况;术后第12周做苏木精-伊红染色切片和甲苯胺蓝染色切片,观察各组大鼠脊髓损伤组织的结构改变。4.将180只SD大鼠随机分为A、B、C、D四组,每组45只,在术后6小时、12小时、1天、3天、7天五个时间点,采集血清标本和脊髓组织,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测大鼠脊髓损伤区NF-κB p65和I-κBαm RNA的表达,免疫印迹(Western Blot)检测大鼠脊髓损伤区I-κBα蛋白的表达情况,凝胶迁移试验(EMSA)检测大鼠脊髓损伤区NF-κB p65的DNA结合活性,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清TNF-α、IL-10水平,观察隔日限食对脊髓损伤大鼠NF-κB信号通路和炎性相关细胞因子水平的影响。结果:1.隔日限食疗法对脊髓损伤大鼠运动功能恢复及脊髓组织结构的影响⑴术前各组大鼠每日进食量与体重没有显著差异。术后4周当中,隔日限食组大鼠在进食日的进食量显著多于自由进食组(P<0.01)。其中,在第2、3周,A组大鼠进食日的进食量较B组大鼠相比增加了约90%(P<0.01,P<0.05),在第2-4周,C组大鼠进食日的进食量较D组大鼠相比增加了约75%(P<0.01)。不过,尽管EODF组大鼠在进食当日的进食量对禁食期间的零摄入量进行了一定补偿,但是其总体摄食量较自由进食组减少(约10%)。术后,A、B、C组大鼠体重呈现出1-3周的下降趋势后逐渐增加,B组和C组大鼠分别在术后8周和3周左右恢复至术前水平,在术后12周A组大鼠体重仍未恢复至术前水平。⑵接受SCI术的A、B组大鼠BBB评分在术后降至最低,随时间逐渐增加。术后1天,A、B组大鼠术后均表现为典型的截瘫体征,无可见后肢运动,BBB评分显著低于假手术组的C、D组,差异具有统计学意义(F=5272.076,P=0.000)。术后第8、10、12周,A大鼠后肢活动改善明显,可见频繁爪掌面承重移动、前后肢协调动作,A组评分高于B组,组间差异有显著性意义(P<0.05)。⑶HE染色:A组:视野中脊髓白质内可见空泡,可见脊髓神经纤维轴突萎缩、髓鞘肿胀。B组:视野中脊髓白质内有许多明显可见的空泡,神经纤维轴突萎缩、髓鞘显著肿胀;可见纤维细胞增生;可见有炎性细胞浸润。C、D组:组织形态结构正常,未见明显病理改变。HE染色结果显示A组大鼠较B组大鼠脊髓损伤病变程度轻,隔日限食对大鼠脊髓损伤具有一定的保护作用。⑷甲苯胺蓝染色:A组:可见脊髓蝴蝶型灰质区损伤严重结构不清,局灶性坏死脱落,神经细胞大量减少,结缔组织增生并伴有炎性细胞浸润;剩余神经元细胞结构完整,胞浆内清晰可见着色均匀琥珀斑状尼氏体;灰质区外白质区神经纤维结构不清,排列紊乱并伴有炎性细胞浸润。B组:可见脊髓蝴蝶型灰质区损伤严重结构不清,大面积坏死脱落,神经细胞大量减少,结缔组织增生并伴有炎性细胞浸润;部分神经元细胞结构不清晰,胞浆内尼氏体结构不清;灰质区外白质区部分神经纤维结构不清。C、D组:可见脊髓蝴蝶型灰质区结构完整清晰,神经元细胞丰富;神经元细胞结构完整,胞浆内清晰可见着色均匀琥珀斑状尼氏体,;灰质区外白质区神经纤维结构清晰,排列整齐。甲苯胺蓝染色结果显示A组大鼠较B组大鼠脊髓损伤病变程度轻,隔日限食对大鼠脊髓损伤具有一定的保护作用。2.隔日限食对脊髓损伤大鼠急性期NF-κB信号通路和炎性相关细胞因子水平的影响⑴模型组与假手术组结果对比:在正常饮食的组别中,B组(脊髓损伤组)即为模型组,D组(假手术组)即为假手术组。与假手术组大鼠相比,模型组大鼠术后NF-κB p65 m RNA的表达有增加趋势;术后6h、12h、3d,I-κBαm RNA的表达水平显著增高(P<0.05);术后6h和1d,I-κBα蛋白表达显著下降(P<0.05),3d上升(P<0.05);术后6h、12h,NF-κB转录活性显著增强(P<0.05);术后12h开始血清TNF-α水平显著升高(P<0.05),呈先升后降趋势,7d恢复(P<0.05),模型组术后各时间点血清IL-10水平显著升高(P<0.05)。上述指标表明,与假手术组大鼠相比,模型组大鼠术后急性期NF-κB信号通路激活,术后3d基本恢复,NF-κB信号通路内相关指标变化符合脊髓损伤后变化,术后促炎性和抗炎性细胞因子分泌启动,与SCI实验模型的基础研究基本一致,印证了脊髓损伤模型的成功建立。⑵实验组与模型组结果对比:在脊髓损伤组别中,A组(脊髓损伤+隔日限食组)即为实验组,B组(脊髓损伤组)即为模型组。与模型组大鼠相比,术后12h、1d,实验组大鼠术后NF-κB p65 m RNA的表达显著增加(P<0.01,P<0.05);I-κBαm RNA的表达水平无明显差异;术后6h,I-κBα蛋白表达显著增加(P<0.05);术后NF-κB转录活性有增强趋势,术后3d显著增强(P<0.01);术后1d,A组血清TNF-α表达水平明显低于B组(P<0.05);术后各时间点,组间血清IL-10水平无明显差异(P>0.05)。上述指标表明,SCI后,隔日限食对急性期炎性反应显示出一定的控制作用,并且实验组大鼠术后NF-κB信号通路激活情况与模型组相比,在激活程度和持续时间上有增强和增长的趋势。⑶不同饮食干预假手术组结果对比:在假手术组别中,C组接受隔日限食,D组自由进食。与自由进食组大鼠相比,C组大鼠术后NF-κB p65 m RNA和I-κBαm RNA各时间点组间差异无统计学意义(P>0.05);术后3d,I-κBα蛋白表达水平明显低于D组(P<0.05);术后1d,NF-κB转录活性明显低于D组(P<0.05);术后1d、7d,TNF-α表达水平明显低于D组(P<0.05);术后各时间点,组间血清IL-10水平无明显差异(P>0.05)。上述指标表明,对于假手术组大鼠,隔日限食显示出减轻炎性反应的作用,并呈现出降低脊髓组织NF-κB转录活性的趋势,可能意味着隔日限食对于未受损和受损脊髓组织的NF-κB信号通路会产生不同的作用。结论:1.辟谷理念在督脉受损病证中显示出有益作用。2.隔日限食对脊髓钳夹损伤模型大鼠具有一定的神经保护作用,进一步验证了该疗法对脊髓损伤实验模型的有效性。3.长期隔日限食可促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能障碍的恢复,与正常饮食对照组相比在术后第8周开始出现显著性差异。4.长期隔日限食可减轻脊髓损伤后的病理损害程度,对脊髓损伤具有一定的神经保护作用。5.隔日限食对脊髓损伤急性期炎性反应显示出一定的控制作用,并且有进一步增加NF-κB活性及激活状态持续时程的趋势,可能是其发挥神经保护作用的分子基础。