随着我国老龄化人口逐渐增加,心血管疾病的患病率和致死率呈逐年上升趋势,严重危害人民生命健康。常见的心血管疾病如心肌梗死、心肌肥厚、高血压性心脏病、动脉粥样硬化以及糖尿病性心肌病等都会引起心肌细胞损伤,诱导心肌成纤维细胞过度增殖和活化,分泌细胞外基质并促进胶原纤维沉积、心脏功能下降和瘢痕组织形成,导致心肌纤维化,最终引起心力衰竭和心源性猝死。因此,探究心肌纤维化的发病机制,延缓心肌纤维化进程是防治心血管疾病的关键因素。环状RNA（circRNA）是由线性m RNA反向剪切形成的,具有闭合环状结构的RNA,其性质稳定、特异性强、保守性高。研究表明,circRNA对冠心病、心肌梗死、心律失常等多种心血管疾病具有关键的调控作用。课题组前期研究发现环状RNA circHelz在急性心肌梗死小鼠心脏中表达上调,通过调控心肌细胞焦亡信号通路,介导心肌缺血损伤。综上所述,我们推测circHelz可能参与调控心肌梗死（4周）引起的心肌纤维化损伤,影响心肌成纤维细胞的增殖和分化。本研究采用在体水平、离体水平和分子水平的研究方法,探究circHelz对小鼠心肌纤维化及心肌成纤维细胞增殖的调控作用,阐明心肌纤维化的发病机制,以期为临床心血管疾病的防治提供新的靶点和策略。本研究主要分为三个部分。第一部分,circHelz对小鼠心肌纤维化的作用研究。1、circHelz在心肌梗死小鼠心脏中表达升高采用C57BL/6小鼠建立心肌梗死诱导的心肌纤维化模型,心肌梗死4周后,通过RT-q PCR实验检测各组小鼠circHelz的表达。结果表明,circHelz在心肌梗死小鼠缺血区心肌组织中表达显著上调。Sanger测序结果证实circHelz序列跨过Helz外显子头尾拼接位点。此外,circHelz的表达不受RNase R和Act D的影响,说明circHelz具有环状性质。上述结果表明circHelz在心肌梗死病理条件下的异常表达可能与心肌纤维化的发生发展有关。2、circHelz对心肌梗死小鼠心肌纤维化的作用C57BL/6小鼠给予干扰circHelz基因表达的腺相关病毒后构建心肌梗死诱导的心肌纤维化模型,采用心动超声检测各组小鼠心脏功能。结果显示,与假手术组相比,心肌梗死组小鼠心脏重量明显增加、射血分数和短轴缩短率下降、左心室舒张末期内径与左心室收缩末期内径升高,而沉默circHelz可以改善上述现象。随后采用Masson染色检测各组小鼠心肌纤维化水平,结果显示沉默circHelz明显逆转心肌梗死引起的胶原纤维增加。此外,检测各组小鼠胶原含量和纤维化相关基因的表达发现,与假手术组相比,心肌梗死小鼠心脏及血清中羟脯氨酸含量显著升高,col1a1、col3a1、α-SMA、CTGF表达显著上调,抑制circHelz可改善上述现象。以上结果表明,敲减circHelz可减轻心肌梗死小鼠心肌纤维化。3、circHelz对AngⅡ诱导的小鼠心肌纤维化的作用C57BL/6小鼠给予干扰circHelz基因表达的腺相关病毒后皮下植入AngⅡ微量渗透泵诱导心肌纤维化模型,进一步探讨circHelz对小鼠心肌纤维化的作用。检测各组小鼠circHelz的表达以及心脏重量发现,与假手术组相比,AngⅡ刺激明显上调心脏circHelz的表达以及心重体重比,沉默circHelz可逆转AngⅡ诱导的circHelz异常表达和心脏重量增加。此外,Masson染色结果显示,沉默circHelz明显减轻AngⅡ引起的心肌组织中胶原纤维增加;RT-q PCR结果显示,沉默circHelz显著抑制AngⅡ引起的心肌组织中α-SMA及CTGF表达上调。以上结果进一步证实circHelz是小鼠心肌纤维化的关键调控因子。第二部分,circHelz对乳鼠心肌成纤维细胞活化的作用研究。1、circHelz在TGF-β诱导活化的心肌成纤维细胞中表达增加首先分离乳鼠及成鼠心肌成纤维细胞,采用TGF-β诱导心肌成纤维细胞的增殖和分化。通过RT-q PCR技术检测各组细胞circHelz的表达,结果显示,与对照组相比,circHelz在TGF-β诱导活化的心肌成纤维细胞中表达明显上调。采用FISH实验检测circHelz在细胞中的分布,结果显示,circHelz在细胞核和细胞质中均有表达,且主要分布在细胞核中。此外,我们还观察到TGF-β刺激可以显著增强circHelz的荧光强度,促进circHelz的表达。上述结果表明circHelz可能参与调控心肌成纤维细胞的活化。2、沉默circHelz抑制乳鼠心肌成纤维细胞的活化在乳鼠心肌成纤维细胞中转染circHelz小干扰RNA后建立TGF-β诱导的细胞活化模型。随后,我们检测各组细胞的增殖、迁移、胶原沉积和向肌成纤维细胞分化情况。结果显示,与阴性对照组相比,TGF-β明显增加心肌成纤维细胞细胞活力和Ed U阳性细胞数目,促进划痕愈合以及col1a1、α-SMA、CTGF m RNA的表达;敲减circHelz可以改善TGF-β引起的心肌成纤维细胞增殖、迁移和分化。表明沉默circHelz可以抑制TGF-β诱导的心肌成纤维细胞活化。2、过表达circHelz促进乳鼠心肌成纤维细胞的活化应用腺病毒建立乳鼠心肌成纤维细胞过表达circHelz模型,检测各组成纤维细胞增殖、迁移和向肌成纤维细胞分化情况。结果显示,与阴性对照组相比,过表达circHelz可以引起细胞活力增强、Ed U阳性细胞数目增多、划痕愈合加快,col1a1、α-SMA、CTGF m RNA的表达上调。实验结果表明过表达circHelz可以促进心肌成纤维细胞的活化。第三部分,circHelz调控心肌纤维化的分子机制。1、心肌纤维化小鼠及活化的心肌成纤维细胞中转录因子NFATc2促进circHelz表达上调通过JASPAR网站预测调控circHelz线性转录本Helz表达的转录因子,结果显示,NFATc2与Helz启动子区域（转录起始点上游2kb）存在12个结合位点,且有5个结合位点评分阈值超过85%。进一步检测NFATc2在心肌纤维化小鼠及活化的心肌成纤维细胞中的表达,发现NFATc2在上述病理情况下表达均明显升高。采用Ch IP-q PCR实验与Luciferase实验对NFATc2与Helz启动子的关系进行验证,结果显示,NFATc2可以与Helz的启动子结合,并促进Helz的表达。此外,沉默NFATc2可以抑制Helz和circHelz的表达,过表达NFATc2则上调Helz和circHelz RNA水平。以上结果说明,转录因子NFATc2可与Helz启动子结合并促进circHelz的表达。2、circHelz调控小鼠心肌纤维化的分子机制Circ RNA可与蛋白结合发挥生物学功能,通过RPISeq网站预测可以与circHelz结合的蛋白,结果显示YAP1与circHelz具有较强的结合能力。RIP实验也进一步证实YAP1可以结合circHelz。Western blot结果显示,YAP1在心肌纤维化小鼠心脏及活化的乳鼠心肌成纤维细胞中表达均显著增加,而沉默circHelz可以抑制YAP1蛋白水平的上调;过表达circHelz则增加YAP1的蛋白表达。由于YAP1只有进入细胞核中才能发挥促进细胞增殖的作用,因此,我们采用免疫荧光检测YAP1在不同条件下的成纤维细胞中分布情况。结果显示,YAP1在TGF-β诱导活化的心肌成纤维细胞细胞核中表达显著增多,而在细胞质中表达减少,抑制circHelz可明显改善TGF-β引起的YAP1的核易位;过表达circHelz则促进YAP1在细胞核中聚积。上述结果说明,circHelz可与YAP1结合并促进其核易位。采用腺病毒建立乳鼠心肌成纤维细胞过表达circHelz模型后转染YAP1小干扰RNA抑制内源性YAP1,随后检测各组细胞增殖、迁移和分化情况。结果显示,沉默YAP1可以明显改善过表达circHelz引起的细胞活力增加、Ed U阳性细胞数目增多、划痕愈合加快以及col1a1、α-SMA、CTGF m RNA的表达上调。表明circHelz可靶向YAP1调控心肌成纤维细胞增殖、迁移、胶原沉积及向肌成纤维细胞的转化。综上所述,本研究首次阐明:1、circHelz在心肌梗死及AngⅡ诱导的小鼠心肌纤维化心脏中表达上调,circHelz是调控小鼠心肌纤维化的关键因子;2、沉默circHelz可抑制TGF-β诱导的心肌成纤维细胞增殖、迁移和向肌成纤维细胞的转化;过表达circHelz促进心肌成纤维细胞的活化;3、转录因子NFATc2可以与Helz启动子结合并促进circHelz在心肌梗死小鼠心脏以及活化的心肌成纤维细胞中表达;4、circHelz可以与YAP1结合并促进YAP1核易位,从而调控心肌成纤维细胞的增殖及活化。本课题为临床治疗和预防心肌纤维化提供新的靶点和策略。