溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)是一种发病原因不明的慢性非特异性炎症疾病,病变部位主要位于结肠黏膜层,与免疫、遗传、感染、环境等多种因素有关,以腹泻、腹痛、黏液脓血便和里急后重为主要临床症状,主要病理特点为结肠黏膜慢性炎症及溃疡形成。流行病学研究表明,UC的年发病率为2～20/10万,患病率为50～100/10万,好发于15～30岁人群。近年来随着人们生活水平的提高、饮食结构及生活方式的改变,该病在我国的发病率有逐年上升的趋势。由于UC病程长,病情轻重不一,常反复发作,患者生活质量严重受限,且长期患者中有5～10%发生癌变,临床至今尚无有效的治疗措施,被世界卫生组织列为现代难治病之一。目前西医对UC的治疗以化学药物为主,主要有柳氮磺胺类、糖皮质激素类和免疫抑制剂等,效果都不够理想,且副作用较大。其中柳氮磺胺吡啶(SASP)是目前临床最常用的药物,适用于轻、中度及慢性UC患者,该药治疗UC的有效率较低,每日服药4g以内,连续一个月,有效率不及50%,而副作用可达37.5%,且复发率为33%。该药疗效及副作用与用量成正比,约有10～15%患者因皮疹、胃肠不适等副作用而停药。中医治疗UC则根据不同分型辩证施治,或清热利湿,或健脾和胃,或行气活血；以内服汤药为主,辅以灌肠。内服药味多,质量不易控制,疗效得不到保障；灌肠给药患者顺应性差,医务人员工作量大,应用极为不方便。苦豆碱(aloperine)是从豆科植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)中提取分离的单体有效成分。该化合物为无色棱柱状结晶,熔点71～73℃,旋光度[a]D+86.59º,具有明显的抗炎、抗变态反应、抗癌、抗病毒、抗菌及抗心律失常等作用。研究表明苦豆碱对多种致炎剂引起的急性炎症和Ⅲ、Ⅳ型变态反应及佐剂关节炎均有显著的抑制作用,其抗炎、抗变态反应作用不依赖于垂体一肾上腺皮质系统,主要与其抑制白细胞(WBC)游走,稳定溶酶体膜,促进自由基清除,抑制淋巴细胞增殖和前列腺素(Prostaglandin, PG)、组胺、淋巴因子等炎症介质的合成、释放及致炎活性有关。本课题组前期进行了苦豆碱对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)致急性期小鼠UC模型的治疗作用及机制研究,结果显示苦豆碱能使结肠炎小鼠腹泻、便血等体征显著减轻,肠黏膜炎症状态明显缓解,疾病活动数(disease activity index) DAI值和组织学评分均低于模型组(P<0.01),表明苦豆碱对DSS致小鼠急性UC具有较好的疗效。其机制可能与抑制结肠组织核因子(NF-κBp65)表达、降低促炎性细胞因子IL-1β、IL-6表达以及提高抗炎因子IL-4水平有关。目前,课题组已向国家专利局申请名为“苦豆碱在制备治疗UC药物中的应用”的一项发明专利(受理号：200910192776.7)。目前市面上尚无有效的治疗UC药物,临床最常用的是SASP,其有效率不及50%,而副作用可达37.5%,且复发率为33%。苦豆碱作为一个新型的抗UC药物,具有疗效确切、副作用低等优点,外加我国十分丰富的苦豆子资源,有着广阔的市场应用前景。肠溶制剂具有以下几个优点：①避免药物被胃酸和胃内酶类破坏,增加药物稳定性；②避免药物对胃黏膜产生强烈的刺激作用,引起恶心、呕吐等不良反应；③将药物传递至肠道发挥局部治疗作用；④提高局部药物浓度；⑤延缓药物吸收的作用。在前期对苦豆碱治疗UC的药理作用研究基础上,本课题拟将苦豆碱开发成治疗UC的肠溶胶囊。具有掩盖苦豆碱的苦味；避免苦豆碱对胃黏膜的刺激；肠道的pH环境利于苦豆碱的吸收等作用。本实验首先对宁夏盐池县主产区的苦豆子不同部位(叶、茎、花、豆荚、种子)中苦豆碱含量进行测定,为提取分离苦豆碱最佳药材部位的选择提供参考；其次对苦豆碱肠溶胶囊进行研制,包括制备工艺、中试试验、建立质量控制标准、制剂的稳定性试验,旨在为后期工业化生产提供相关的数据资料。1目的通过对苦豆碱提取方法和检测条件的研究,对苦豆子不同部位(叶、茎、花、豆荚、种子)中苦豆碱含量进行测定,为提取分离苦豆碱最佳药材部位的选择提供参考；综合考察吸湿百分率、休止角、堆密度及体外释放度等指标,确定苦豆碱肠溶胶囊最佳的处方组成和制备工艺；通过对处方临界相对湿度的测定,为制剂生产过程中车间湿度的控制提供参考；进行三批中试试验,验证制剂工艺的可行性；建立苦豆碱肠溶胶囊的质量标准；对苦豆碱肠溶胶囊进行稳定性试验,探讨影响药物稳定性的因素,为制剂生产、运输、贮存过程中环境条件控制和包装材料的选择以及有效期的制定提供依据。2方法2.1苦豆子不同部位中苦豆碱的含量测定采用HPLC法,以苦豆碱含量为指标,考察提取溶剂、提取方法、提取次数及提取时间等因素对提取效率的影响,优化苦豆碱的提取方法。同时对测定方法进行方法学考察,包括线性关系考察、精密度、重复性、稳定性及加样回收率试验等。2.2苦豆碱肠溶胶囊制备工艺研究采用固定漏斗法测定不同处方的休止角,采用量筒法测定不同处方的堆密度,采用桨法对不同处方进行体外释放度考察,同时对不同处方吸湿百分率进行测定,综合上述试验结果,确定最佳的辅料和配比。测定已确定处方的临界相对湿度,为生产过程中车间的湿度控制提供参考。在《药品生产质量管理规范》(GMP)要求的设备和实验条件下,以10倍处方的投料量进行三批中试试验,并对中试样品的成品率、装量差异和含量均匀度进行考察。2.3苦豆碱肠溶胶囊质量标准的建立采用薄层色谱法(TLC)鉴别苦豆碱；采用HPLC法测定苦豆碱的含量；采用HPLC法对有关物质进行检查,通过破坏性试验对检测方法的专属性进行考察：采用桨法在pH1.2、6.8的溶出介质中进行药物体外释放度考察,并制定苦豆碱肠溶胶囊的质量标准。2.4苦豆碱肠溶胶囊的稳定性试验影响因素试验：取一批去除外包装的制剂,分别在高温(60℃)、高湿度(25℃,RH90±5%)、强光照射(4500±5001x)条件下放置10天,在第0、5、10天取样检测,重点考察外观性状、有关物质、含量以及溶出度有无显著变化。加速试验：取三批按市售包装(塑料瓶包装)包装的制剂,在40士2℃、RH75±5%条件下放置6个月,分别在第0、1、2、3、6个月末取样检测,重点考察外观性状、有关物质、含量以及溶出度有无显著变化。长期试验：取三批按市售包装(塑料瓶包装)包装的制剂,在25±2℃、RH60±10%条件下放置12个月,分别在第0、3、6、9、12个月取样检测,重点考察外观性状、有关物质、含量以及溶出度有无显著变化。将结果与0月比较,以确定药品的有效期。由于试验数据的分散性,一般应按95%可信限进行统计分析,得出合理的有效期。3结果3.1苦豆子不同部位中苦豆碱的含量测定苦豆碱的最佳提取条件为氨水浸润30min,甲醇超声提取30min。苦豆子叶、茎中苦豆碱的含量分别为0.38%、0.02%,豆荚、花、种子中不含苦豆碱。3.2苦豆碱肠溶胶囊制备工艺研究淀粉、微晶纤维素与苦豆碱的混合物吸湿率最低,当苦豆碱：淀粉：微晶纤维素=10：15：5时,药物2h内在酸液(pH=1.2)中没有溶出,45min内在缓冲液(Ph=6.8)中释放量为99.24%,平均休止角为29.5°,平均堆密度为0.3640g/ml。苦豆碱肠溶胶囊的最终处方为：苦豆碱(67g)、淀粉(100g)、微晶纤维素(33g),混合均匀后,装入肠溶空心胶囊,制成1000粒。三批中试样品的成品率分别为94.6%、93.1%和94.9%,装量差异及含量均匀度检查均符合要求。3.3苦豆碱肠溶胶囊质量标准的建立苦豆碱肠溶胶囊中苦豆碱的薄层鉴别,斑点清晰(Rf=0.69),具有专属性。采用HPLC法测定苦豆碱肠溶胶囊中苦豆碱的含量,方法学验证结果表明,方法稳定、准确、重现性好。采用]HPLC法对破坏样品产生的有关物质进行测定,各杂质与主成分分离效果较好,说明方法具有专属性。体外释放度试验表明,三批样品2h内在pH为1.2的溶出介质均无溶出,45min内在pH为6.8的溶出介质中的释放量分别为99.58%、99.44%、98.01%,符合相关规定。3.4苦豆碱肠溶胶囊影响因素试验、加速稳定性以及长期稳定性试验影响因素试验表明,苦豆碱肠溶胶囊在高温、高湿、强光照射下放置10天后,与第0天相比,外观性状、含量、有关物质、酸中及缓冲液中释放量均无显著变化。加速稳定性试验表明,三批苦豆碱肠溶胶囊在40±2℃、RH75±5%条件下放置6个月后,与第0天相比,外观性状、含量、有关物质、酸中及缓冲液中释放量均无显著变化。6个月的长期稳定性试验结果显示,三批苦豆碱肠溶胶囊在25±2℃、RH60±10%条件下放置6个月后,与第0天相比,外观性状、含量、有关物质、酸中及缓冲液中释放量均无显著变化。4结论所建立的高效液相色谱方法准确、稳定、重复性好,可以作为苦豆子中苦豆碱的含量测定方法；苦豆子不同部位苦豆碱含量测定结果显示,叶子中苦豆碱含量最高,因此可以将叶子作为提取分离苦豆碱的最佳药材部位；苦豆碱肠溶胶囊制备工艺稳定可行,质量稳定可控,且体外溶出试验显示具有良好的肠溶性能,适合于后期工业化生产。