本学位论文得到两项科研项目的资助——江苏省中药炮制重点实验室课题(ZYPZ009)、南京中医药大学基础研究课题(10XJC07)资助。2010版《中国药典》收载采用麸炒法炮制的有山药、白术、苍术、芡实、枳壳、枳实、椿皮、薏苡仁及僵蚕9种中药。前8中麸炒之后具有明显的增强健脾的作用,僵蚕麸炒后矫嗅矫味,本论文使用临床上常用的典型的健脾药(山药、白术、苍术、薏苡仁)为研究对象进行研究。本论文在中医药理论的指导下,结合现代科学方法,提出“中药麸炒炮制中产生的焦香味物质是基于梅拉德反应形成”的观点,论文以梅拉德反应为基础,模拟麸炒炮制条件合成一系列梅拉德反应的产物,以白术、山药、薏苡仁、苍术为代表性药物,比较麸炒前后药物与梅拉德反应的产物的GC-MS、LC-MS指纹图谱,发现在麸炒过程中能够生成系列由梅拉德反应形成的具有焦香味的物质(2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、5-羟甲基糠醛、糠醛、半胱氨酸、胱氨酸以及半胱氨酸葡萄糖苷),对这些物质进行健脾活性研究,发现梅拉德反应的产物2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、5-羟甲基糠醛、糠醛、半胱氨酸、胱氨酸以及半胱氨酸葡萄糖苷具有健脾活性,麸炒炮制的过程中这些成分在炒后的麦麸中具有一定的比例,利用麦麸炒制后产生的梅拉德反应产物的比例进行健脾效应验证。研究表明以麦麸炒制药物,在炒制的温度下麦麸中的糖和氨基酸等可产生梅拉德反应,反应产物经过缩合形成的产物(2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、5-羟甲基糠醛、糠醛、半胱氨酸、胱氨酸以及半胱氨酸葡萄糖苷)具有焦香味,并具有一定的健脾作用,这些在麸炒过程中产生的焦香味物质是麸炒焦香健脾的物质基础。本论文为进一步阐明麸炒健脾的炮制原理奠定了科学依据和理论基础。主要工作内容和研究结果包括以下几个方面：(一)文献研究麸炒近年来的文献资料研究表明麦麸在增强疗效、缓和药性和矫臭矫味上效果显著,麦麸中部分成分对多种疾病有预防或治疗作用,麸炒对药物的成分有明显的影响。梅拉德反应又称“非酶棕色化反应”,主要指还原糖与氨基酸、蛋白质之间的复杂反应,梅拉德反应产生的物质大多具有香味,麦麸在炒制过程中产生强烈的焦香味,麦麸中含有大量的糖、蛋白质、氨基酸等物质,本文由此提出“麸炒炮制药物,在麦麸炮制过程中产生的焦香味以及炮制理论中麸炒‘焦香健脾’功效与麸炒时麦麸中的糖和蛋白质、氨基酸等通过梅拉德反应产生的反应产物有关”。(二)健脾药物麸炒炮制前后化学成分的色质联用分析以药典规定的8种麸炒的药物为代表进行麸炒炮制,并采用GC-MS检测分析,观察到8种麸炒饮片均有经梅拉德反应产生的共性物质：乙酸、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、糠醛以及5-羟甲基糠醛。其中：2-甲基丁醛具有咖啡香味,3-甲基丁醛具有苹果香味,糠醛则具有新鲜烤焦面包的气味,5-羟甲基糠醛具有焦糖味辛香及坚果香气。LC-MS检测分析,发现麸炒后的苍术、白术、山药、薏苡仁中均有共性物质半胱氨酸、胱氨酸以及半胱氨酸葡萄糖苷。其中半胱氨酸及胱氨酸主要作为烘焙食品中的增香剂。对炮制过程中,半胱氨酸、胱氨酸的形成做验证研究。结果发现半胱氨酸是由蛋氨酸与丝氨酸通过加热形成,半胱氨酸的巯基再缩合形成具有双硫健的胱氨酸,半胱氨酸和麦麸中的糖形成半胱氨酸葡萄糖苷,这些物质均具有明显的焦香味。中医一般认为炒制后的中药产生的焦香味有“焦香健脾”的作用。焦香气味对于促进食欲具有明显作用,具有健脾功效。根据检测到的成分的性质和麸炒炮制的方法,本学位论文提出“麸炒焦香健脾作用与麦麸炒制药物后产生的焦香味物质具有相关性,炒制过程中麦麸和药物中含有的糖与氨基酸等经梅拉德反应产生的焦香味产物是其焦香健脾作用的共性物质基础”的假说。(三)模拟麸炒条件合成梅拉德反应的产物及健脾作用研究实验以麸炒炮制条件进行模拟合成一系列梅拉德反应的产物(2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、5-羟甲基糠醛、糠醛、半胱氨酸、胱氨酸以及半胱氨酸葡萄糖苷),采用大鼠D-木糖排泄及唾液淀粉酶活性试验,实验结果表明,不同温度条件下的梅拉德反应产物均对大鼠的唾液淀粉酶的活性产生影响,相比较之下100℃和120℃麸炒炮制条件的梅拉德反应产物对大黄所致大鼠脾虚的治疗效果较为明显。在大鼠脾虚尿中D-木糖排泄率的试验中,模拟麸炒条件的100℃以及120℃梅拉德反应产物组的治疗大鼠脾虚的活性较强。本实验验证了麸炒条件下氨基酸和糖缩合的梅拉德反应产物可改善动物脾虚病理指标,同时也在一定程度上反映了梅拉德反应的最适宜温度,大约在100℃-120℃之间,这与麸炒炮制时药材饮片内部的温度一致,为中药麸炒炮制焦香健脾的物质基础研究奠定了基础。(四)4种中药麸炒后梅拉德反应共性物质的含量测定1、GC-MS法测定典型麸炒中药(白术、山药、苍术、薏苡仁)不同炮制品中2-甲基及3-甲基丁醛的含量以4种2010版药典法定麸炒的药材(白术、苍术、山药、薏苡仁)分别进行清炒,麸炒,将各药材的生品,清炒品,麸炒品和从表面刮下来的物质进行GC-MS测定,通过对同一品种不同炮制品的GC-MS图谱的比较,寻找共性的焦香味物质2-甲基丁醛,3-甲基丁醛的含量变化趋势。结果发现经过麸炒的白术、山药、薏苡仁和麸炒药物表面刮取物中2-甲基丁醛和3-甲基丁醛的含量较生品和清炒品大幅增加；但苍术中的含量没有明显的规律。结论：白术、山药、薏苡仁经过麸炒后,产生的2-甲基丁醛,3-甲基丁醛等物质较生品含量增加,以从麸炒药物表面刮取物的含量最高,这说明麸炒产生的物质能够吸附在药材表面。2、UPLC法测定(白术、山药、苍术、薏苡仁)不同炮制品中5-羟甲基糠醛及糠醛的含量麸炒焦香健脾,糠醛又称麸醛,具有明显的焦香味,本文首次采用UPLC及HPLC法,比较4种药物的生品、麸炒品、清炒品中5-羟甲基糠醛及糠醛含量的变化,由结果表明,炒制品中5-羟甲基糠醛、糠醛含量较生品增加,说明加热可促进5-羟甲基糠醛、糠醛的产生；而麸炒品中5-羟甲基糠醛、糠醛含量最高,说明单纯加热以及麦麸炒制都可促进5-羟甲基糠醛、糠醛的产生。5-羟甲基糠醛、糠醛是麸炒过程中麦麸发生梅拉德反应(麦麸中糖与氨基酸)的产物。麸炒品表面层比麸炒品高近20倍,进一步说明麸炒过程中产生的梅拉德反应的产物能够吸附在药物的表面,使得药物产生焦香味,这种结果也符合中药麸炒焦香健脾的理论。3、UFLC-MS法测定(白术、山药、苍术、薏苡仁)不同炮制品中半胱氨酸、胱氨酸及半胱氨酸葡萄糖苷的含量采用色谱柱为Shim-pack氨基柱(3.0 mm×100 mm,5μ m),流动相为乙腈-0.1%甲酸75：25,流速为0.4 mL·min-1,柱温40℃。质谱采用ESI+离子源、MRM检测模式。麸炒品中梅拉德反应产物半胱氨酸,半胱氨酸葡萄糖苷及胱氨酸含量明显高于清炒品,而生品饮片中几乎测不出,麸炒饮片表面层中半胱氨酸,半胱氨酸葡萄糖苷及胱氨酸明显高于麸炒饮片。进一步说明麸炒过程中产生的梅拉德反应的产物能够吸附在药物的表面,使得药物产生焦香味,这种结果也符合中药麸炒焦香健脾的理论。(五)利用不同药理模型验证麸炒过程中梅拉德反应产物的健脾的作用在含量测定的基础上,按照梅拉德反应产物在药物麸炒炮制前后药物中的比例,配制不同化合物组合,制成生品组、麸炒组合组、半胱氨酸、胱氨酸等,分别进行药理实验。实验结果表明,药物均对大鼠的唾液淀粉酶的活性产生影响,相比较之下麸炒组、半胱氨酸及胱氨酸组对大黄所致的整体大鼠脾虚模型具有更强的活性。在脾虚大鼠尿中D-木糖排泄率的试验中,麸炒组、半胱氨酸糖苷组、半胱氨酸及胱氨酸的作用较强。兔离体回肠试验结果表明,不同的梅拉德反应产物对家兔离体回肠的收缩作用的影响强度也不同,其强弱顺序依次为：5-羟甲基糠醛、糠醛、半胱氨酸缩合、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛,其中以5-羟甲基糠醛作用尤为明显。结论：麸炒焦香健脾作用的共性物质来源于麦麸和药物中糖、氨基酸和蛋白质发生梅拉德反应的产物(2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、5-羟甲基糠醛、糠醛、半胱氨酸、胱氨酸以及半胱氨酸葡萄糖苷)。创新点：1.论文首次提出麸炒物质焦香健脾的共性物质基础为麦麸炒制药物过程中麦麸和药物的糖、氨基酸、蛋白质等经过梅拉德(Maillard)反应的产物。2.论文首次成功模拟麸炒条件合成Maillard反应的产物,并对反应产物进行健脾活性的研究,发现梅拉德反应的产物具有焦香味,确实可以起到使脾虚大鼠D-木糖的排泄率下降、唾液淀粉酶的活性增强及离体回肠的运动增加。3.采用GC-MS检测发现在麸炒的药物中含有梅拉德反应的4个醛类物质,含量测定表明,这4中物质麸炒炮制含量明显增加,在麸炒成品中形成比较固定的比例,并具有较强的健脾活性。4.采用LC-MS检测发现麸炒炮制的药物中含有梅拉德反应的产物：半胱氨酸、胱氨酸及半胱氨酸葡萄糖苷,这些反应产物同样具有较强的健脾活性。5.本文首次发现2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、糠醛、5-羟甲基糠醛、半胱氨酸、胱氨酸及半胱氨酸葡萄糖苷是麸炒炮制药物中具有焦香味,并具有健脾作用的共性物质基础。