应激性是生物体的普遍特性。应激(Stress)是指机体受到各种应激原刺激时出现的以交感神经兴奋性增高和下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPAaxis)过度激活为主的一系列神经内分泌反应。HPA轴持续反复激活导致其终末靶腺肾上腺皮质分泌过多的GC,是应激反应的最重要特征。海马对应激反应有整合作用,对GC的分泌起非常重要的调节作用,是HPA轴应激反应的高位调节中枢,是慢性应激损伤的敏感区。生理剂量的GC对机体有益,而过量的GC则对机体有害,特别是对海马神经元产生不良作用。细胞凋亡是GC导致海马神经元损伤的其中最主要机制之一。已有研究表明,淫羊藿具有改善学习记忆功能及抑制神经细胞凋亡的作用。但淫羊藿苷对皮质酮所致海马神经元损伤保护作用的具体机制尚未见报道。　　 研究目的:探讨淫羊藿苷对皮质酮诱导的大鼠原代培养海马神经元损伤保护作用的可能机制。　　 研究方法:　　 1.采用新生24h以内Sprague-Dawley大鼠原代培养海马神经元。　　 2.采用MTT法和LDH释放法观察皮质酮诱导的原代培养海马神经元的存活率以及淫羊藿苷干预后的影响。　　 3.采用Hochest33258、TUNEL原位荧光染色、线粒体跨膜电位以及caspase-3分光光度法检测淫羊藿苷干预后对原代培养海马神经元凋亡的影响。　　 4.采用荧光分光光度法利用Fura2-AM荧光探针检测淫羊藿苷干预后海马神经元胞内游离钙离子浓度的变化。　　 5.采用DCFH-DA荧光探针检测淫羊藿苷干预皮质酮诱导的海马神经元活性氧的水平并检测细胞内总SOD的含量。　　 6.采用Westernblot蛋白检测方法探索淫羊藿苷神经保护作用的可能作用信号转导通路MAPK和P13K/Akt。　　 研究结果:　　 1.1形态学结果显示,1uM和10uM浓度的CORT对海马神经元的作用较明显,其突触、包膜和胞核均有不同程度的损伤,表现为突起断裂,包膜不完整,胞体膨胀,胞核固缩,而10nM、50nM、100nM几乎对神经元无作用。淫羊藿苷能够逆转这种损伤作用。　　 2.2MTT法和LDH法结果显示,1uM和10uM浓度的CORT作用于原代培养海马神经元24h后,其细胞存活率分别为58.1％和44.7％,作用于48h后分别下降为46.3％和16.8％,至72h后,其细胞存活率均接近15％,且呈浓度和时间依赖性下降,用10-5-10-6mmol/L三个浓度的淫羊藿苷预处理2h,然后和1uM的皮质酮共孵育24h,发现淫羊藿苷能明显减少皮质酮干预后的神经元的损伤,与对照组相比有显著性差异(p＜0.01),但三个剂量之间无明显差异。SB203580是MAPK通路中p38MAPK特异性阻断剂,LY294002是P13K/Akt信号转导通路中P13K的抑制剂,采用这两个阻断剂分别特异性阻断这两条信号转导通路,则淫羊藿苷的保护作用被抵消。　　 3.3HochesG3258,TUNEL原位荧光染色、线粒体跨膜电位以及capase-3检测结果显示,大鼠海马神经元暴露于1uM皮质酮24h后出现明显的核浓缩和胞体膨胀,而正常对照组则表现为圆形的细胞核形态。给与10-6mmol/L淫羊藿苷干预后,与模型组比较,核固缩的神经元比例大幅降低。皮质酮干预海马神经元24h后,经TUNEL法检测可见较多的凋亡阳性细胞,数个成群分布,表现为细胞核红色着染、核染色质浓缩与边移等凋亡细胞的形态特征。而正常组只有较少的红染得凋亡阳性细胞。用淫羊藿苷干预后,细胞核红染的凋亡阳性细胞比例减少,提示淫羊藿苷能够抑制皮质酮所致的海马神经元凋亡。用Rhodamine123荧光探针检测神经元内线粒体跨膜电位,染色结果显示,正常对照组几乎见不到绿色荧光,而皮质酮干预组绿色荧光非常强,淫羊藿干预后,绿色荧光减弱。Caspase-3检测结果显示,模型组较空白对照组caspase-3的OD值明显升高,有统计学意义(P＜0.01);淫羊藿处理后其OD值和相对活性有极显著的降低(P＜0.01)。　　 4.本研究发现1uM皮质酮作用于海马神经元24h后,其胞内钙荧光强度较空白对照组明显升高,统计学上有显著性差异(P＜0.01),用10-6mmol/L淫羊藿苷干预后能显著抑制有皮质酮引起的海马神经元胞内游离钙离子浓度的异常升高,统计学上有显著性差异(P＜0.05)。　　 5.在本研究中我们采用DCFH-DA荧光探针进行活性氧的检测,同时检测神经元总SOD,结果显示,皮质酮干预海马神经元后,表现为绿色荧光增强,提示神经元活性氧水平升高,但淫羊藿苷干预后无变化。同时,总SOD结果也显示,淫羊藿对皮质酮所致的海马神经元总SOD下降无逆转效应。表明淫羊藿苷的保护作用可能与氧化应激无关。　　 6.我们采用Western blot方法检测ICA对皮质酮所致海马神经元损伤保护作用。在参照文献基础上,我们选择了四个时间点30min,1h,2h,3h。结果显示皮质酮作用于30min内显著诱导了MAPK三个关键信号分子p38MAPK,ERK1/2和JNK的激活,且3h内持续激活,用ICA预处理2h,抑制了p38MAPK的激活,且随着作用时间的延长,其抑制作用越强。但是ICA对ERK1/2和JNK的激活无影响。结果显示,ICA对皮质酮所致的海马神经元损伤有显著的保护作用,并且在损伤的最初就显示了良好的保护作用。　　 7.我们采用western blot方法检测ICA对皮质酮所致海马神经元损伤保护作用。在参照文献基础上,我们选择了四个时间点30min,1h,2h,3h。结果显示皮质酮作用于30min内显著抑制了P13K/Akt信号转导通路中关键分子Akt的磷酸化,且3h内持续抑制,用ICA预处理2h,激活了AKT的磷酸化,且各个时间点无明显差别。结果显示,ICA对皮质酮所致的海马神经元损伤有显著的保护作用,并且在损伤的最初就显示了良好的保护作用。　　 结论:　　 1.淫羊藿苷对皮质酮诱导的原代培养海马神经元损伤具有保护作用,其可能与抑制神经元凋亡、降低神经元胞内钙超载有关,但与神经元的氧化应激无关。　　 2.淫羊藿苷对神经元损伤保护作用的信号转导机制与MAPK和PI3K/Akt有关,从而抑制神经元的凋亡,这可能就是其神经保护作用的机制之一。