证候是中医理论的特色之一,它指导着中医临床诊治的实施,并充分体现了中医整体观、动态变化、个体性等特点,因而成为近年来中医研究的热点。随着目前现代医学水平的发展,基因组学、蛋白质组学的研究工作已经成为医学中最为重要的研究方向。疾病的产生多是由于基因、蛋白等功能紊乱造成,且其调控表达功能与中医理论极为相似,因此,利用基因组学、蛋白质组学技术研究证候理论是当前一热点的方法。肝郁证是中医肝病的主要证候,是临床常见的证候之一,具有重要的研究意义。作为一类复杂证候,肝郁证表现不仅涉及肝本身病变,也关系到全身其它多脏腑系统的复杂病变。它可产生高级神经中枢调节机制紊乱,涉及到神经、内分泌、循环、消化、免疫、感觉、运动等多系统多方面病理改变。而目前对肝郁的研究只在某些层面上反映了部分已知基因表达产物(受体、酶、细胞因子以及肽类等)的改变,远未揭示肝郁证的实质。而证候的复杂表现应有其物质基础,这种物质基础最终可能是由于基因水平上的调控发生紊乱。基于上述认识,本文主要从以下方面进行了研究:1 理论研究随着后基因组时代的来临,生命科学的研究重点已经从结构基因组学开始转向功能基因组水平,这种更重视基因功能、更强调相互作用关系和整合的理念,与中医的学术思想不谋而合。本文从证候出发,阐释了它所具有的整体观、功能观、动态观、个体化等特色,并研究了其目前存在的问题;同时分析了基因组学、蛋白质组学目前研究所显示出的特点,进而探讨了运用基因组学、蛋白质组学研究证候的可行性。证候研究作为中医学发展的重点与核心,面对这种契机和趋势,已有学者提出证候基因组学、证候蛋白质组学概念。在此基础上,二者相互融合与渗透而产生的新学科,其深入研究有可能大力推动中医证候学的飞速发展,使之向一个更深层次迈进。2 实验研究实验研究主要从以下两个方面进行:2.1 肝郁证动物模型的复制。在前期实验结果的基础上,本研究再次利用慢性温和不可预知应激方法重复了肝郁证动物模型,并进行了 1%蔗糖水摄取量的行为学和血浆 ACTH 应激激素表达水平的测定。实验进行了 4 次,实验动物均使用 SD 雄性大鼠,随机分为正常对照组(正常组)、应激模型组(模型组)、应激模型加阿米替林组(西药组),应激模型加逍遥散组(中药组),采用慢性温和不可预知应激方法造模。造模第 1 天与第 22 天均测定了各组大鼠 1 小时 1%蔗糖水摄取量。末次处理的 24 小时后(第 22 天),麻醉大鼠,动脉取血 2ml,抗凝处理,离心取上清备用。结果显示:实验初期,各组大鼠 1%蔗糖水摄取量经统计组间无差异,实验第 22 天,模型组 1%蔗糖水摄取量明显低于正常组,中药组与模型组间无统计学差异,但多次实验均显示数据高于模型组,具有对抗应激的趋势;血浆 ACTH 结果与 1%蔗糖水摄取量结果较一致,亦显示模型组与正常组组间<WP=5>IV 慢性应激肝郁证大鼠模型的复制及相关基因表达的研究有统计学意义,模型组血浆 ACTH 高于正常对照组,说明应激导致了动物体内激素水平的改变。肝郁模型在行为学及神经内分泌学方面重复得到验证。 2.2 通过 Northern 杂交对前期实验分离出的差异显示 cDNA 片段进行了验证,以发现与肝郁证密切相关的基因表达片段,从而对肝郁证实质和机理进行研究。造模方法同上,动物造模末次处理后,快速断头处死,冰上取脑,分离海马,液氮冻存备用。用 Trizol 试剂一步法提取模型大鼠海马总 RNA,并进行甲醛变性凝胶电泳转膜,将其转至硝酸纤维素膜上固定;另一方面,将前期实验差异扩增出的 cDNA 片段进行α-32P 同位素标记,与海马总 RNA 进行了 Northern 杂交,以验证前期实验 DDRT-PCR 结果。本次实验重复了 6、15 和 17 号片段,并又进行了 2、9、11、12、18 号的杂交验证,8 条差异显示片段在各组间均有表达,但统计分析组间无显著性差异,即未显示与 DDRT-PCR 相同的结果。抑郁情绪和异常行为的发生作为肝郁证证候学研究的重要部分,其研究方式向来重视宏观的行为观察和药效实验,而对于在基因组水平上的本质研究可以说仍有不少空白,因而无法在根本上阐明肝郁证发生、发展的病理机制。本实验在前期差异显示扩增(DDRT-PCR)的基础上,用 Northern 杂交验证以期发现与肝郁证相关的基因表达。实验结果显示 Northern 杂交有表达但无差异,分析可能为多基因的协同表达在其中起了关键作用。限于时间和经费等因素的制约,上述结果有待进一步研究验证。