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目的本实验采用DA大鼠胶原诱导关节炎（collagen induced arthritis，CIA）模型，从类风湿性关节炎滑膜新生血管生成的角度，部分揭示海蛇治疗类风湿性关节炎的作用机制，并为中医运用虫类药通络治疗痹证提供科学依据。方法1动物分组及处理将30只雄性DA大鼠随机分为3组：空白对照组、CIA模型组、海蛇治疗组，每组10只。参照文献，于实验开始第一天，取适量大鼠Ⅱ型胶原，将其溶于0.1M乙酸，配成浓度为2mg／mlⅡ型胶原溶液，此溶液再与等量完全Freund’s佐剂（CFA）混合，充分乳化后，按150μgⅡ型胶原／只大鼠，于尾根部皮下注射，空白对照组以等量生理盐水于尾根部皮下注射。造模第15d，海蛇组按1.84g／kg·d，1ml／100g体重灌胃给药，空白对照组及模型组分别按1ml／100g体重给予生理盐水灌胃，治疗后30d乙醚麻醉下取全血；处死动物，取膝关节用多聚甲醛固定36h后，放入10％EDTA·Na2溶液脱钙备用。2指标检测2．1关节炎指数（Arthritis Index，AI）的计算造模后第15d开始观察并记录全身关节病变程度。根据《现代药理实验方法》一书中的方法，关节积分每周两次，以判断其大体发病率。全身病变按5级评分法评价，4只肢体的病变程度累计积分，计算出AI。0分：无红肿；1分：小趾关节红肿；2分：趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。把各个关节的积分累计起来，即为每只大鼠的AI，每个动物最大为16分。2．2大鼠膝关节光镜观察取大鼠的膝关节用多聚甲醛固定，10％EDTA·Na2溶液脱钙，酒精逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，常规HE染色。光镜下观察滑膜、软骨、骨的病理改变。2．3外周全血T细胞亚群检测样品测定管中各加入50μl抗凝血，然后每管中加入相应的抗体10μl，振荡混匀，4℃冰箱避光孵育30min，加入1ml 0.84％NH4Cl溶血素，振荡混匀，室温避光放置5min，1200r／min离心3min弃上清液，加入PBS 1ml，1200r／min离心3min弃上清液（PBS共洗涤两次），加入PBS400μ1，混匀后上机检测。2．4外周血TNF-α、IFN-γ细胞因子及抗CⅡ抗体含量检测外周血TNF-α、IFN-γ含量检测，具体流程如下：一抗包被塑料板4℃过夜；将包被有特异抗体的塑料板洗1次；向凹孔内加250μl Assay Buffer封闭，室温（20～25℃）反应2h；洗板2次；加50μl样品稀释液和50μl检测样本（标准孔内加入标准品）；加50μl生物素标记的第Ⅱ抗体，室温2h；洗板4次；加100μl链亲合素标记的辣根过氧化物酶，室温1h；洗板3次；加100μl TMB，避光，室温20～30min；加100μl终止液；读板（450nm）。外周血抗CⅡ抗体含量检测，具体流程如下：用10μg／ml小牛关节软骨CⅡ包被塑料板4℃过夜，每孔50μl，含CⅡ0.5μg；洗板1次；向凹孔内加100μl1％BSA-PBS封闭，室温1h；洗板2次；加100μl稀释样品血清（标准孔内加入标准品），室温2h；加50μl生物素化山羊抗大鼠抗体，室温1h；洗板4次；加100μl链亲合素标记的辣根过氧化物酶，室温30min；洗板3次；加100μl TMB，避光，室温15min；加100μl终止液；读板（450nm）。2．5大鼠膝关节滑膜VEGF、Flk-1、Flt-4、Ang-2、Tie-2、TNF-α、IFN-γ阳性细胞检测取大鼠的膝关节多聚甲醛固定，10％EDTA·Na2溶液脱钙，酒精逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，进行VEGF、Flk-1、Flt-4、Ang-2、Tie-2、TNF-α、IFN-γ的免疫组化检测。PV-6001染色法：脱蜡、水化组织切片；3％H2O2孵育10min以消除内源性过氧化物酶活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min；石蜡切片胰蛋白酶抗原修复；滴加10％正常血清封闭非特异性抗原孵育20min；倾去血清；分别加入相应一抗体，4℃过夜（以PBS代替一抗作阴性对照）；PBS冲洗5min×3次，滴加通用型IgG抗体（Fab段）-HRP多聚体，37℃孵育30min，PBS冲洗5min×3次；DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片；干燥后观察结果。每张切片随机选取6个视野拍照，计算每个视野中阳性表达面积的百分比值，累计相加后取平均值即为此张染色片的阳性表达面积的百分比值。2．6统计学分析实验结果用均数±标准差（（?）±s）表示，数据经方差齐性检验确定方差齐同后采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。结果1大鼠AI变化：从第24d开始CIA模型组AI明显高于海蛇治疗组，统计学差异显著，且从第24d到第45d海蛇治疗组AI逐渐降低。结果表明海蛇乙醇提取物治疗效果明显。2 HE染色光镜观察结果：CIA组大鼠膝关节光镜观察可见滑膜细胞增生明显，滑膜组织充血水肿，毛细血管增生，血管内膜变形增生，管腔变窄或阻塞，血管翳形成，关节软骨退行性变，关节面破坏，并可见炎细胞浸润。海蛇乙醇提取物治疗后增生的滑膜组织内的炎细胞、滑膜细胞及毛细血管数量减少，滑膜增生及滑膜组织水肿明显减轻，新生血管显著减少，血管内膜增厚减轻，少见血管翳形成，关节面破坏减轻。3外周血T细胞亚群的检测结果：在免疫后45d，CIA组CD4、CD8与空白对照组相比均明显升高；海蛇组与CIA组相比，CD4、CD8明显下降，尤其是CD4显著降低（P＜0.01），海蛇组与空白对照组相比较无显著性差异。4血清中抗CⅡ抗体含量的检测结果：CIA组抗CⅡ抗体含量显著升高，表明CⅡ可能是RA致病的潜在抗原。海蛇治疗组抗Ⅱ型胶原抗体含量较CIA组明显降低，表明海蛇组关节损伤较CIA组明显减轻，释放的Ⅱ型胶原减少。5血清中TNF-α、IFN-γ含量的检测结果：CIA组血清中TNF-α含量较空白对照组显著升高，TNF-α是一种主要的炎性因子，与VEGF的表达呈正相关，促进滑膜血管增生，在RA的发病中起重要作用。海蛇治疗组TNF-α含量较CIA组明显降低，统计学差异显著，表明海蛇可通过多环节抑制新生血管生成。CIA组IFN-γ含量较空白对照组明显升高，表明CIA主要表现为Th1型器官特异性的自身免疫病。海蛇乙醇提取物可通过调节免疫系统，显著降低IFN-γ的表达，从而阻断了由IFN-γ大量分泌形成的恶性循环。海蛇治疗组IFN-γ含量明显低于CIA组，统计学差异显著。6大鼠膝关节滑膜VEGF、Flk-1、Flt-4、Ang-2、Tie-2、TNF-α、IFN-γ阳性细胞检测结果：CIA组VEGF、flk-1、flt-4增高的同时，Ang-2、Tie-2表达亦增高，与空白对照组相比差异显著，表明VEGF与Ang-2协同作用促进新生血管生成。CIA组TNF-α、IFN-γ的阳性表达较空白对照组明显升高，TNF-α与VEGF的表达呈正相关关系。海蛇治疗组大鼠膝关节滑膜VEGF及其受体Flk-1、Flt-4的表达与Ang-2、Tie-2的表达均明显降低，且TNF-α、IFN-γ的表达显著降低，与CIA组相比统计学差异显著。结论海蛇治疗类风湿性关节炎的功效与抑制RA新生血管生成相关，海蛇乙醇提取物不仅可直接抑制VEGF／VEGFR通路和Ang-2／Tie-2的表达发挥抑制滑膜新生血管生成的功效，还可通过调节免疫系统，降低IFN-γ、TNF-α等炎性因子的分泌而间接抑制滑膜新生血管生成。