【摘 要】
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质粒DNA的应用已广泛深入到科学研究,农业检测,医疗诊断等领域,在临床应用上如DNA疫苗和基因治疗等方面也倍受瞩目,而临床应用的前提就是需要获得满足注射用质量要求的超螺旋结构质粒DNA。因此,在本课题研究中,我们根据质粒DNA的理化性质,制定了三步色谱层析纯化方案（分子筛色谱,亲和色谱,阴离子交换色谱联用）,用于质粒DNA的制备。具体地,我们选用固定相材料(SepharoseTM6 Fast Fl
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质粒DNA的应用已广泛深入到科学研究,农业检测,医疗诊断等领域,在临床应用上如DNA疫苗和基因治疗等方面也倍受瞩目,而临床应用的前提就是需要获得满足注射用质量要求的超螺旋结构质粒DNA。因此,在本课题研究中,我们根据质粒DNA的理化性质,制定了三步色谱层析纯化方案（分子筛色谱,亲和色谱,阴离子交换色谱联用）,用于质粒DNA的制备。具体地,我们选用固定相材料(SepharoseTM6 Fast Flow,Plasmid Select Xtra,SOURCETM30Q)进行填充,并对分离纯化条件进行优化,实现了从宿主菌体及其内容物和质粒DNA异构体中纯化超螺旋质粒DNA的目的,且该方法与其他常用方法（试剂盒法,CTAB法等）相比,具有简单,高效,经济,质量可控,适用性广,易于扩大等优点。在确定了前期纯化工艺的可操作性后,我们选择了一种针对HBV ccc DNA的CRISPR/Cas9表达质粒作为纯化对象,通过优化纯化工艺,检测产物质量,进行了注射用超螺旋质粒分子的生产和纯化,并参考了《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》和相关产品（重组人肝细胞生长因子质粒DNA,HIV DNA疫苗,等）,制定了质量标准。通过对纯化产物CRISPR/Cas9质粒DNA在纯度,相关杂质残留,生物效力等方面的检测和重复验证,确定了其质量达标和可重现性,为这一质粒产品的临床应用打下了基础。
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