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目的： 葡甘低聚糖是一种具有多种特殊生理功能的寡聚糖，可以预防肥胖症、糖尿病、龋齿等多种疾病的发生，减轻人体因摄入过多热量而产生的负担，是新型的功能低聚糖。 本论文运用现代发酵技术及酶工程学原理，利用微生物产酶水解魔芋精粉来制备葡甘低聚糖。在前期工作的基础上，对自行筛选的一株产高活性葡甘聚糖酶的细菌进行鉴定，摸索细菌生长和产酶的规律，优化产酶条件，并以摇瓶培养结果为依据，用5 L发酵放大培养细菌，进一步优化放大发酵条件，此外，对发酵液中的葡甘聚糖酶进行提取并纯化，探索出一套纯化葡甘聚糖酶的理想方案，建立完整的葡甘低聚糖制备工艺，试图为工业生产葡甘聚糖酶提供理论依据，为工业化生产葡甘低聚糖提供技术指导。 方法： 首先运用常规方法观察细菌形态，并对20多种生理生化特征进行鉴定，根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对细菌特征进行检索，为细菌分类到种并命名。为了了解细菌生长和产酶规律，在摇瓶培养过程中摸索细菌生长的最适培养基及最佳培养时间，通过正交试验确定摇瓶培养条件的最佳配伍，并在此基础上进行细菌的放大生产，再次利用正交试验对放大发酵条件进行优化。发酵得到的葡甘聚糖酶经过盐析、分子筛层析和离子交换层析三个步骤进行分离纯化，纯化后的酶蛋白用聚丙烯酰胺常规电泳进行纯度鉴定，变性电泳测定其平均分子量，同时对酶作用的最适pH和最适温度等特性进行研究，调整酶反应环境，提高酶效。综合试验数据，在其指导下进行葡甘低聚糖的生产小试，对发酵液的凝聚剂种类和凝聚条件进行研究，同时对粗提酶用于葡甘低聚糖生产的实际可行性进行模拟，了解粗酶作用比率、时间、温度、pH等条件，测定水解产物的总糖含量和还原糖含量，薄板层析法分析产品的寡糖种类，计算原料转化率和增值率。 结果： 1．通过鉴定，该菌属于芽孢杆菌属，具有耐盐、耐热、液化明胶、水解淀粉、可运动、好氧兼性厌氧等特点，与芽孢杆菌属中其他种相比较应该是一个新种，目前暂时将其命名为耐热芽孢杆菌Bacillus thermodurans。 2．Bacillus thermodurans产酶的最适培养基为蛋白胨1％、牛肉膏粉0.3％、魔芋精粉2％、NaCl0.5％、K2HPO40.2％，培养条件的最适温度为40℃，pH7.2，振荡速度120rpm，培养时间为24h。该条件下培养的获得的粗酶液平均比活力可达3859U／mg。n摘要 3.正交试验分析结果显示，SL发酵罐培养的最适条件为温度50℃，PH 6.2，发酵初期搅拌速度为200 rpm，通气量为40眺，6h后变为搅拌速度100 rpm，通气量20眺，得到的最高酶比活力可达4403U/mg。刀狡‘illus thermodurans生长周期较短，6h后即进入对数期，26h后进入稳定期，期间出现二次生长现象。与生物量积累情况相比，所产酶的活性上升速度更快，直至24h后才开始有明显下降，整个过程中pH值变化幅度极小，而溶氧值由于发酵液粘度变化及需氧量变化起落较大。酶蛋白的产量与菌体积累量密切相关，发酵动力学属于偶联型。 4.盐析浓度在朋80%范围内葡甘聚糖酶的活性较高，将该浓度下沉淀的蛋白质经Sepharose 6B分子筛层析和DEAE一52离子交换层析分离出达到电泳纯的酶蛋白。纯化倍数达到6.7，酶活回收率为67.14%。该酶降解魔芋精粉时的Km=lomg/血L，Vmax=6.67mg/血Lmln。SDS一PAGE测定结果表明纯化后的葡甘聚糖酶由三种亚基组成，推断其中可能含有其他分子量接近的蛋白质或为葡甘聚糖同工酶，结果有待进一步验证。 葡甘聚糖酶在温度为50℃，PH为5.6一5.8时活力最高。低温对酶活影响不大，40℃以下酶可在Zoh内保持较高活性，而pH对酶活影响相对显著，在pHSPH7范围内酶的活力可保持大约10h左右，PHS时则大大降低了酶的活性。金属离子和有机物往往对酶反应有比较大的影响，对该葡甘聚糖酶来说，znZ十和FeZ+对酶的反应有明显的抑制作用，其他试验的离子和有机物则未见显著的抑制或激活性。 5.在SL发酵罐上对葡甘低聚糖进行实验性生产的主要工艺为用0.05%（岁1 00 mL）氯化钙和0.1%（留1 00 mL）磷酸氢二钠处理培养24h的发酵液，去除菌体和固体颗粒后在低温下进行4080%浓度的盐析，得到葡甘聚糖粗酶，脱盐后直接与魔芋精粉以1:300（w八V）的比例混合，50℃下保温10h，充分水解后4 000 rpm下离心，去除未降解的魔芋粉，得到葡甘低聚糖浆，最后由喷雾干燥得到低聚糖粉。经测定葡甘聚糖的转化率为66.6%，糖粉中总糖含量为90.11%，13.09%，薄板层析结果显示糖粉中单糖浓度很低，聚糖酶可能是一种内切酶。小试生产的葡甘低聚糖产品有较奸的复溶性，还原糖含量为所产生的葡甘液体透明无异味，不需对产品进行脱色和除单糖等特别处理，生产工艺比较简单，所使用的仪器和试剂成本也较低，生产流程不对环境造成污染，是一个经济效益和社会效益都相当可观的课题项目。