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目的:观察人乳腺癌MDA-MB-231细胞在缺氧及血清饥饿环境下侵袭、迁移能力的改变;研究抗血管生成药物,重组人血管内皮抑素(rh-endostatin,商品名:恩度,endostar)及贝伐珠单抗(bevacizumab,商品名:阿瓦斯汀,Avastin)在血清饥饿及缺氧环境中对人乳腺癌MDA-MB-231细胞系侵袭及转移能力的影响,探讨长期抗血管生成药物治疗在临床应用中的潜在风险。方法:取生长状况良好的对数期人乳腺癌MDA-MB-231细胞,CCK-8法计算恩度及贝伐单抗对MDA-MB-231细胞有效抑制(约30%)时的浓度,将其作为工作浓度完成后续实验。将细胞分为a组为完全血清组:a1为完全血清对照组,a2为完全血清+恩度处理组,a3为完全血清+贝伐单抗处理组;b组为缺氧+完全血清组:b1为缺氧+完全血清组对照组,b2为缺氧+完全血清组+恩度处理组,b3为缺氧+完全血清组+贝伐单抗处理组;c组为血清饥饿组,c1为血清饥饿对照组,c2组为血清饥饿+恩度处理组,c3组为血清饥饿+贝伐单抗处理组;d组为缺氧+血清饥饿组,d1为缺氧+血清饥饿对照组,d2为缺氧+血清饥饿+恩度处理组,d3为缺氧+血清饥饿+贝伐单抗处理组。处理后的细胞进行Transwell细胞侵袭实验及细胞迁移实验,Western Blot检测c-Met及MMP-9表达情况。恩度及贝伐单抗在血清饥饿环境下处理的MDA-MB-231细胞及血清饥饿对照组细胞经ExiqonmiRBase 18.0 microRNA芯片杂交,用Real-time PCR法验证杂交芯片试验中差异有明显统计学意义且与肿瘤有关的10个microRNA,分别为miR124,miR505,miR2355,miR10a,miR324,miR1915,miR375,miRlet-7d,miR519。结果:1.CCK-8法检测细胞抑制率结果:恩度浓度为800mg/L时,贝伐单抗浓度为80mg/L时,作用时间为48h时,药物对MDA-MB-231的抑制率可达到约30%,根据文献,30%抑制率视为有效抑制,故我们选择恩度800mg/L,贝伐单抗80mg/L为工作浓度,48h为作用时间完成后续实验。2.Transwell细胞侵袭、迁移实验结果:血清饥饿环境下,侵袭、迁移过基底膜的细胞数量明显增多。血清饥饿+恩度/贝伐单抗实验组及血清饥饿+缺氧+恩度/贝伐单抗实验组,侵袭、迁移穿过基底膜的细胞个数明显高于单纯血清饥饿的对照组细胞(P<0.05)。缺氧环境对细胞侵袭、迁移能力作用不大,差异没有统计学意义(P>0.05)。3.Western Blot结果:血清饥饿环境下,细胞c-Met及MMP-9明显升高,缺氧环境没有影响细胞c-Met及MMP-9表达。血清饥饿+恩度/贝伐单抗实验组及血清饥饿缺氧+恩度/贝伐单抗实验组c-Met及MMP-9表达量较单纯血清饥饿对照组增加(P<0.05),缺氧环境对细胞c-Met及MMP-9表达量影响不明显,差异没有统计学意义(P>0.05)。4.microRNA芯片杂交结果:结果用倍数变化(FC,fold change)表示,P<0.05时有统计意义。共有38个miRNA倍数变化有统计意义。其中与肿瘤相关的 miRNA 共有 10 个。分别为 miR124,miR505,miR2355,miR10a,miR324,miR1915,miR375,miRlet-7d,miR519。5.Real-time PCR结果:验证杂交芯片差异有意义的miRNA,包括miR124,miR505,miR2355,miR10a,miR211,miR1915,miR375,miRlet-7d,miR519,miR576在内的10个miRNA,只有miR2355及miR375变化稳定,与对照组差异明显有统计学意义(P<0.05)。血清饥饿环境下,细胞miR2355及miR375表达明显下调。血清饥饿+恩度/贝伐单抗实验组miR2355及miR375表达量较单纯血清饥饿对照组下调(P<0.05),缺氧环境中,miR2355及miR375未见明显变化,差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:本研究在体外模拟抗血管治疗后肿瘤细胞所处之微环境,从细胞、蛋白及基因水平证实,血清饥饿环境增加了人乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭、迁移能力;在血清饥环境下,恩度及贝伐单抗这两种抗血管生成药物没有逆转侵袭能力的增加了反而增加肿瘤的侵袭及转移能力。MDA-MB-231细胞对缺氧环境不敏感。miR375和miR2355可能作为判断抗血管生成治疗是否过度的早期预警标记物。