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目的:观察毒死蜱对大鼠海马神经元自噬相关蛋白表达的影响,探讨自噬在急性毒死蜱中毒中枢神经损伤中的作用。方法:采用81.5mg/kg(1/2LD50)毒死蜱建立急性毒死蜱中毒动物模型,60只健康成年雄性SD大鼠,随机分为两组,每组30只。其中30只用于病理组织标本制备,另30只用于自噬相关蛋白检测。再分别按体重随机区组分为6组(colntrol、1/2d、2d、7d、14d、21d),每组5只。一次性灌胃染毒,对照组给橄榄油灌胃。染毒后连续观察大鼠一般情况和中毒症状,每天测量1次体重。根据观察时间点留取大脑海马组织标本及断头血,血浆Ach E检测用于评价染毒模型制备情况;硫堇染色观察海马组织病理变化;免疫荧光染色形态观察自噬小体形成及LC3蛋白表达;Western blot检测海马组织中自噬相关蛋白Beclin1、P62/SQSTM1、LC3的表达。将15只健康成年雄性SD大鼠随机分为3组(control、CPF、CPF+3-MA),每组5只。给予毒死蜱81.5mg/kg一次性灌胃染毒,control组给予橄榄油灌胃;染毒后0.5小时给予3-MA 50ug/100g腹腔注射,control、CPF组给予生理盐水腹腔注射。观察并记录大鼠一般情况,于染毒后2天取海马组织标本,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、P62/SQSTM1、LC3及凋亡相关蛋白Bax、Bcl2的表达。结果:1急性毒死蜱中毒SD大鼠模型制备染毒模型制备中,实验大鼠全部存活。染毒组大鼠在灌胃后逐渐出现明显急性毒死蜱中毒症状,中毒症状在染毒后24小时内逐渐加重,24-48小时症状逐渐减轻,48小时后中毒症状基本消失。与对照组相比,染毒组在染毒后体重明显下降,在染毒第3天降至最低,此后缓慢增加,染毒第12天与对照组相当。与对照组相比,染毒组体重差异自染毒后第2天-第11天有统计学意义(P<0.05)。血清胆碱酯酶测定与control组相比(2.53±0.35 U/ml),染毒组血浆Ach E活力在中毒后12h明显降低(0.45±0.26 U/ml,P<0.01),48h仍持续在较低水平(0.44±0.29 U/ml,P<0.01),第7天有所恢复(1.61±0.40 U/ml,P<0.01),但仍明显低于对照组,第14、21天血浆乙酰胆碱酯酶活力水平(2.63±0.62U/ml、2.70±0.43 U/ml)恢复至对照组水平(P>0.05)。2 CPF对海马神经元自噬相关蛋白表达的影响2.1硫堇染色结果control组海马神经元形态完整,分层整齐排列;1/2d组与control相比变化不明显;2d组神经元数量略有减少,神经元排列略显松散,细胞形态尚可;染毒后7d组变化最为明显,神经元数量明显减少,细胞轮廓模糊,排列紊乱;14d、21d组神经元形态较完整,排列较整齐,神经元数量较7天组有所增多。2.2 Western blot检测结果Beclin1:随着中毒时间延长,Beclin1蛋白表达量呈先增多后下降趋势,2d表达最高。与control相比2d、7d组差异有统计学意义(P<0.05),0.5d、14d、21d组差异无统计学意义(P>0.05)。LC3:随着中毒时间延长,LC3Ⅱ蛋白表达量呈逐渐增高趋势,2d表达最高,此后逐渐下降,14d表达下降至最低,与对照组相当,21d组再次升高。与control相比1/2d、2d、7d、21d组LC3Ⅱ表达量增高(P<0.05),14d组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。P62/SQSTM:与control组相比,P62/SQSTM蛋白表达量12h组明显升高(P<0.05);2d表达量明显降低(P<0.05);此后表达量升高至对照组水平,7d、14d组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);21d组P62/SQSTM表达量高于对照组水平(P<0.05)2.3免疫荧光染色control组LC3表达均匀,且在较低水平,胞浆内未见明显LC3Ⅱ颗粒状聚集现象;1/2d组荧光强度较control明显增加,表明LC3整体表达增强,胞浆内可见少量LC3Ⅱ呈颗粒状聚集;2d组LC3表达最强,LC3Ⅱ呈颗粒聚集明显增加;7d组LC3表达较2d组略减弱,可见LC3Ⅱ颗粒状聚集,较2d组减少;14d组LC3表达明显下降,与control组水平相当,胞浆内未见明显LC3Ⅱ颗粒状聚集现象;21d组LC3表达再次升高,LC3Ⅱ颗粒状聚集可见,但不明显。3自噬在急性毒死蜱中毒海马神经元损伤中的作用3.1 Western blot检测3-MA对自噬相关蛋白表达影响LC3Ⅱ:CPF组与control组相比,LC3Ⅱ表达明显增高(P<0.01),CPF+3-MA组与CPF组相比LC3Ⅱ表达明显降低(P<0.01),CPF+3-MA与control组差别无统计学意义(P>0.05);Bclin1:CPF组与control组相比,Beclin1表达明显增高(P<0.05),CPF+3-MA组与CPF组相比Beclin1表达明显降低(P<0.05),CPF+3-MA与control组差别无统计学意义(P>0.05);P62/SQSTM:CPF组与control组相比,P62/SQSTM表达明显降低(P<0.05),CPF+3-MA组与CPF组相比P62/SQSTM表达明显升高(P<0.05),CPF+3-MA与control差别无统计学意义(P>0.05);3.2 Western blot检测3-MA对凋亡相关蛋白表达影响。Bax:CPF组与对照组相比,Bax表达明显升高(P<0.05),CPF+3-MA组与CPF组相比Bax表达继续升高(P<0.05)。Bcl2:CPF组与对照组相比,Bcl2表达明显降低(P<0.05),CPF+3-MA组与CPF组相比Bcl2表达继续降低(P<0.05)。结论:1.急性毒死蜱中毒早期激活了海马神经元自噬,自噬体降解受阻、自噬功能紊乱可能参与了毒死蜱诱导的海马神经元损伤。2.适当的激活自噬水平,提高自噬通量,维持自噬稳态可能有利于减轻急性毒死蜱中毒海马神经元损伤。