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坦布苏病毒病自2010年4月在我国东部沿海地区(福建、浙江等)爆发以来,以其传播范围广、传播速度快及感染率高等特点迅速蔓延到大部分养鸭省份,对水禽养殖业健康发展构成严重威胁。本病病原为属于黄病毒科、黄病毒属的坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV),以引起雏鸭瘫痪,产蛋鸭产蛋下降为主要特征。当病原微生物入侵机体时,天然免疫应答作为首先响应并做出相应抵抗反应的体系,在为宿主建立起抗病毒免疫中发挥重要作用。其中,I型干扰素(IFN-I)是近些年研究最为广泛,且与天然免疫关系最为密切的一类抗病毒蛋白。目前有关TMUV研究表明,其编码的非结构蛋白(NS proteins)能够特异性靶向IFN-I信号通路中关键接头蛋白,阻碍IFN-I产生,证实TMUV具有免疫抑制作用。因此,为更加系统地揭示TMUV与天然免疫应答关系,本研究首先确定TMUV拮抗IFN-I信号转导过程,其中NS5蛋白发挥关键抑制作用;随后探讨了TMUV-NS5阻碍IFN-I下游JAK-STAT信号通路具体机制,为TMUV乃至其他黄病毒与天然免疫应答关系研究提供有效借鉴。本研究主要包括以下几方面内容:1.TMUV负调控IFN-I信号转导IFN-I经刺激产生后,需要与相应受体(IFNAR)相结合,通过JAK-STAT信号通路转导后发挥抗病毒作用。本研究中,首先对TMUV感染是否能够影响IFN-I抗病毒效应进行分析,对已经感染TMUV(0.2,1 MOI)细胞应用IFN-α(50,500 U/m L)刺激,检测到TMUV转录及蛋白表达水平没有因IFN-I作用而受到显著抑制,推测TMUV对IFN-I免疫应答具有拮抗作用。已知干扰素刺激基因(ISG)是IFN-I发挥抗病毒效应的执行者,而IFN刺激反应元件(ISRE)是调节ISGs表达的关键因子。为进一步验证上述结果,对未感染或感染TMUV(0.2,1 MOI)细胞应用IFN-α(500 U/m L)刺激,检测相关ISGs(ISG56、ISG56、Mx1、OAS1)表达水平及ISRE启动子活化是否受到TMUV影响。结果显示,TMUV感染显著降低了IFN-α诱导的ISGs转录水平及ISRE活性;随后,应用水泡性口炎病毒(VSV)作为参照,未感染或感染TMUV(1 MOI)细胞经IFN-α(500 U/m L)刺激后,再感染一定剂量VSV。结果显示,IFN-α处理显著抑制了VSV增殖,表明IFN-I具有较强的抗病毒作用,而在TMUV感染细胞中,VSV增殖几乎没有受到影响。以上试验结果充分证实,TMUV负调控IFN-I信号转导,进而加重病毒感染。2.TMUV-NS5抑制IFN-I信号转导分子机制现有结果显示,黄病毒NS蛋白在病毒复制、翻译及拮抗宿主天然免疫方面发挥重要作用。因此本研究以TMUV编码NS蛋白为研究对象,深入探讨其抑制IFN-I信号转导通路JAK-STAT分子机制。将NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5真核表达质粒分别与荧光素酶报告质粒(p ISRE-TA-luc)及内参质粒(p RL-SV40)共转染至HEK293细胞,经IFN-α(1000 U/m L)作用后应用双荧光素酶报告基因试验筛选到TMUVNS5显著抑制ISRE活化;与以上结果相似,应用荧光定量PCR(real-time PCR)试验检测到在HA-NS5转染组细胞中,ISGs转录水平也受到显著抑制。已知IFN-I在与定位于细胞膜表面的IFNAR结合后,磷酸化通路中关键转录因子,随后磷酸化的信号转导和转录激活子(p STAT1、p STAT2)与干扰素调节因子9(IRF9)形成干扰素刺激基因因子3(ISGF3)复合物进入细胞核中完成信号传递,诱导数以百计的ISGs表达,最终为宿主建立起免疫状态。为探明TMUV-NS5靶向JAK-STAT信号通路中哪一关键环节,将空载体及HA-NS5真核表达质粒分别转染至HEK293,经IFN-α(1000 U/m L)处理后检测到其对于酪氨酸激酶(JAK1)、IFNAR1、STAT1、STAT2及IRF9蛋白表达水平没有抑制作用,也没有阻碍JAK1、STAT1及STAT2磷酸化水平;免疫共沉淀(co-IP)试验也显示其对于STAT1及STAT2并不具有靶向性;此外,对ISGF3形成情况进行分析后发现,TMUV-NS5没有阻碍复合物形成,却抑制其进入细胞核过程。根据以上结果,本研究证实,与多数黄病毒NS5蛋白发挥作用机制有所不同,TMUV-NS5通过阻碍STATs核移位过程,进而拮抗IFN-I信号转导。3.TMUV-NS5阻碍ISGF3核移位分子机制上述研究表明TMUV-NS5可以阻断ISGF3向细胞核内转运,进而抑制IFN-I信号转导过程,其中转录因子STAT1经磷酸化后在核转运蛋白Importinα5(亦称KPNA1)协助下进入细胞核中。因此,本研究将空载体及HA-NS5真核表达质粒分别与MycKPNA1共转染至HEK293及Hela细胞,经IFN-α(1000 U/m L)刺激后,通过co-IP试验检测到TMUV-NS5阻碍了KPNA1与p STAT1相互作用,进而导致后者核移位过程受阻。为证实以上结果是否与核转运蛋白表达水平下降相关,本研究随后将空载体及HANS5真核表达质粒分别转染至Hela细胞,结果显示TMUV-NS5没有阻碍核转运蛋白表达,但通过进一步试验却发现其与协助p STAT1进入细胞核的关键转运蛋白KPNA1相互作用,并且在KPNA1过表达的HEK293细胞中,ISGs转录水平显著上调,而TMUV复制水平受到抑制。根据以上结果,本研究证实TMUV-NS5通过与KPNA1发生相互作用,阻碍ISGF3复合物向细胞核内转运过程,进而拮抗IFN-I信号转导。4.TMUV-NS5与核转运蛋白互作关键区域分析核定位信号(NLS)是大分子蛋白(一般大于40 k Da)氨基酸序列中被Importinα(KPNA)识别并结合的关键区域。本研究中,对TMUV-NS5氨基酸序列进行分析后,首先确定了两段潜在的NLS,可能是KPNA1识别TMUV-NS5并介导二者发生相互作用的关键区域。其中,NLS-P1(28～46 aa)位于TMUV-NS5氨基端且位于蛋白三维结构表面,多种预测方法均指向这一段区域,增加了预测的可靠性;并且其可介导串联表达的EGFP蛋白(2×EGFP)完全定位于细胞核中,表明其具有核定位作用。而NLS-P2(369～405 aa)是在黄病毒中研究较为广泛的一段核定位信号(即α/βNLS),已知DENV、ZIKV等黄病毒被Importinα(KPNA)识别的关键位点均位于这一区域内,但不同黄病毒间氨基酸差异性较大。为进一步确定以上预测结果,本研究构建了删除NLS-P2突变体表达质粒HA-NS5(Contain NLS-P1)及删除NLS-P1突变体表达质粒HA-NS5(Contain NLS-P2),并将其分别与Myc-KPNA1共转染至HEK293细胞。经co-IP试验结果显示,与删除NLS-P2相比,删除NLS-P1的突变体HA-NS5(Contain NLS-P2)与KPNA1相互能力显著减弱;此外对NLS-P1区域进行进一步截短后证实,位于TMUV-NS5氨基端的序列(37～46 aa)是介导其与KPNA1互作的关键区域。