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目的:本研究旨在通过天然噬菌体纳米抗体文库筛选出能与EGFR-ECD3结合的纳米抗体,为癌症的靶向治疗提供材料与依据。方法与结果:（1）重组质粒构建。用PCR技术从EGFR胞外段全长中扩增EGFR-ECD3基因片段并添加不同信号肽序列,插入至真核表达载体p CMV上,经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,确认重组质粒p CMV-EGFR-ECD3以及p CMV-Gluc-EGFR-ECD3构建成功。（2）胞外段表达。将重组质粒瞬时转染HEK293F细胞,结果表明重组蛋白在上清中分泌表达。再通过规模放大,瞬转至HEK293F细胞,随后用Ni-NTA亲和层析柱纯化,最终获得高纯度EGFR-ECD3蛋白,纯度大于90%。ELISA、CCK8细胞增殖实验以及Western Blot实验,证明所获得的EGFR-ECD3与EGF蛋白有较强结合活性,其EC50为0.034μmol/L,且能有效抑制由EGF引起的肿瘤细胞A549增殖（抑制率达65%）和其细胞表面内源性EGFR的磷酸化。（3）纳米抗体筛选。首先,扩增辅助噬菌体VCSM13,计算滴度为5×10 12 cfu/m L,使用纯化得到的EGFR-ECD3蛋白进行包板,利用大容量天然噬菌体纳米抗体文库首轮扩增,再经过3轮淘洗、富集验证,后再筛选,最终获得1株纳米抗体,命名为NbH3。生物信息学分析可知,NbH3有122个氨基酸,CDR1、CDR2和CDR3分别含有10、7和16个氨基酸,其分子量（Mw）为13225.56,等电点（PI）为7.82,总平均亲水性（GRAVY）为-0.579,为亲水性蛋白。（4）纳米抗体表达。提取p MECS-NbH3质粒,将其电转进E.coli WK6中,用终浓度为1m M的IPTG诱导表达,然后使用渗透压冲击法提取NbH3,用Ni-NTA柱纯化,经Western Blot实验及灰度扫描验证,获得纯度高达95%的NbH3蛋白,蛋白产量约为5 mg/L。（5）纳米抗体生物学和理化性质分析。通过间接性ELISA检测NbH3结合效力、结合特异性及热稳定性;再通过竞争性ELISA检测其与EGF共同竞争EGFR的能力。结合效力实验表明,NbH3能与EGFR-ECD3有较好的结合,其EC50值为0.486μmol/L;特异性实验表明,NbH3特异性结合EGFR-ECD3,而与其它对照抗原的结合能力很弱,特别是它不与同家族的HER2蛋白发生交叉性结合;热稳定性实验证明,NbH3在60℃及以上温度较长时间处理下具有明显优势;竞争性ELISA表明,NbH3能与EGF竞争的结合EGFR,竞争率约为25%。（6）纳米抗体生物学活性分析。CCK8实验表明,NbH3可与EGF竞争结合细胞表面的EGFR,从而抑制由EGF所引起的A549细胞增殖,抑制率为30%;磷酸化实验表明,Nb H3能在一定程度上抑制由EGF诱导的细胞表面EGFR的磷酸化;利用免疫荧光以及流式细胞术实验,检测显示出NbH3能较好的识别到A549细胞膜上的EGFR。结论:本文成功构建EGFR-ECD3的质粒,并通过瞬时转染至真核表达系统HEK293F,最终纯化获得具有较高生物学活性且高纯度的EGFR-ECD3重组蛋白,经三轮淘洗从噬菌体纳米抗体文库中筛选得到1株纳米抗体。其具有较好结合效力、热稳定性高和特异性强等优点,且与A549细胞膜上EGFR蛋白有一定的结合能力。综上所述,筛选出的纳米抗体具有开发成EGFR抑制剂的潜力,为其后续应用开发提供了物质材料。