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第一部分三七皂苷R1改善糖皮质激素抑制哮喘小鼠气道上皮损伤修复的作用研究目的:观察三七皂苷R1是否对糖皮质激素抑制哮喘小鼠气道上皮的损伤修复具有治疗作用。方法:利用屋尘螨(HDM,House dust mites)滴鼻建立小鼠哮喘模型,在最后3次激发之前半小时给予糖皮质激素-地塞米松(Dex,Dexamethasone)腹腔注射小鼠,同时腹腔注射三七皂苷R1(PNS-R1,Panax notoginseng saponins R1)溶液。末次激发24小时内利用有创肺功能气管插管检测小鼠肺功能,收取小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF,Bronchoalveolar lavage fluid)标本,利用细胞计数仪计数肺泡灌洗液中细胞总数,瑞氏染色后计数细胞分类情况及BALF中脱落的细胞数。收集小鼠气管及左肺组织进行脱水石蜡包埋切片后,进行HE染色和免疫组化E-cadherin染色,观察小鼠气道上皮细胞损伤修复情况;利用TUNEL染色观察小鼠气道上皮细胞凋亡情况,免疫组化和Western blot技术检测肺组织气道上皮中凋亡蛋白Caspase3表达情况;PAS糖原染色观察小鼠气道粘液分泌情况。ELISA检测肺泡灌洗液中上皮损伤相关因子IL-33和TSLP含量。结果:1.哮喘小鼠肺通气阻力、气道炎症和气道粘液分泌较对照组明显增加,Dex和PNS-R1均可以明显减轻哮喘小鼠肺通气阻力、气道炎症以及气道粘液高分泌,但Dex和PNS-R1共同治疗组的小鼠肺通气阻力、气道炎症以及气道粘液分泌与单纯使用Dex治疗的小鼠无差异。2.Dex治疗哮喘小鼠会明显增加BALF中脱落的上皮细胞数和损伤相关因子IL-33和TSLP含量,降低气道上皮细胞完整性;在Dex的基础上加用PNS-R1会明显减少BALF中脱落的上皮细胞数和损伤相关因子IL-33和TSLP含量,提高气道上皮细胞完整性。3.Dex治疗哮喘小鼠会明显增加气道上皮细胞凋亡的百分比以及Caspase3蛋白的表达,在Dex的基础上加用PNS-R1会明显减少气道上皮细胞凋亡的百分比以及Caspase3蛋白的表达。结论:Dex可以明显的抑制哮喘小鼠气道上皮细胞损伤修复,促进气道上皮细胞凋亡;在使用Dex治疗的小鼠中同时使用PNS-R1可以明显的改善Dex抑制哮喘小鼠气道上皮损伤修复的作用,同时减少气道上皮细胞的凋亡,最终促进哮喘小鼠气道上皮损伤的修复。第二部分三七皂苷R1改善糖皮质激素抑制支气管上皮细胞生长的作用研究目的:观察三七皂苷R1是否可以改善糖皮质激素抑制支气管上皮细胞生长的作用。方法:体外培养人支气管上皮细胞株16HBE,用Dex和PNS-R1对细胞进行干预。利用CCK-8技术检测细胞生长情况;Transwell实验和划痕实验检测支气管上皮细胞的迁移能力;细胞克隆实验和细胞周期实验检测支气管上皮细胞增殖能力的变化。同时利用TUNEL实验和流式Annexin-Ⅴ技术检测支气管上皮细胞凋亡情况。Western blot技术检测支气管上皮细胞中凋亡蛋白Caspase3表达情况。结果:1.Dex明显抑制16HBE的增殖和迁移,加入PNS-R1干预后16HBE细胞的迁移和增殖能力明显增加。2.Dex可以促进16HBE细胞的凋亡,加入PNS-R1干预后16HBE细胞凋亡明显减少。3.Dex干预的细胞中凋亡蛋白Caspase3表达明显增多,加入PNS-R1干预的细胞中凋亡蛋白Caspase3较Dex组明显降低,差异有统计学意义。结论:Dex可抑制支气管上皮细胞的迁移和增殖,同时促进支气管上皮细胞的凋亡;在Dex干预的16HBE细胞中加入PNS-R1同时干预可以明显改善Dex抑制支气管上皮细胞迁移增殖的作用,同时减少Dex诱导的支气管上皮细胞凋亡,最终达到促进支气管上皮生长的作用。第三部分三七皂苷R1通过GRβ影响MAPK信号通路改善糖皮质激素抑制哮喘气道上皮损伤修复的机制研究目的:探究三七皂苷R1改善糖皮质激素抑制哮喘气道上皮损伤修复的具体作用机制。方法:收集临床对哮喘患儿和对照组患儿外周血标本,利用Western blot技术检测血中单核细胞GRβ蛋白表达情况。利用Western blot、免疫组化、免疫共沉淀等实验技术检测Dex或/和PNS-R1干预的小鼠哮喘模型肺组织标本中糖皮质激素受体(GR,Glucocorticoid receptor),MAPK信号通路的变化。慢病毒转染敲低哮喘小鼠体内GRβ基因,收取小鼠支气管肺泡灌洗液标本瑞氏染色后计数BALF中脱落的细胞数。收集小鼠气管及左肺组织进行脱水石蜡包埋切片后,进行HE染色和免疫组化E-cadherin染色,观察小鼠气道上皮细胞损伤修复情况;ELISA检测肺泡灌洗液中上皮损伤相关因子含量;同时收集小鼠肝肾组织和血清进行检测。体外培养16HBE,利用Western blot,免疫组化,免疫共沉淀等实验技术检测Dex或/和PNS-R1干预的细胞GR,MAPK信号通路的表达情况。然后利用si-RNA敲低细胞中的GRβ后再用Dex或/和PNS-R1对细胞进行干预,利用Transwell实验和划痕实验检测支气管上皮细胞的迁移能力;细胞克隆实验和细胞周期实验检测支气管上皮细胞增殖能力的变化。Western blot技术检测MAPK信号通路表达情况。结果:1.临床哮喘使用糖皮质激素患儿外周血标本中GRβ蛋白表达较哮喘未使用糖皮质激素组明显降低,哮喘未使用糖皮质激素组较对照组表达也降低,差异有统计学意义。2.Dex可明显抑制16HBE细胞中GRβ表达,减少GRα/GRβ结合,MAPK信号通路的激活也明显降低。加入PNS-R干预后GRβ表达增多,促进GRα/GRβ结合,进而促进MAPK信号通路的激活。3.敲低16HBE细胞中的GRβ,PNS-R1改善Dex抑制16HBE细胞迁移增殖的能力明显降低,MAPK信号通路激活明显降低。4.Dex可明显抑制哮喘小鼠肺组织和气道上皮细胞中GRβ表达,加入PNS-R干预后GRβ表达增多。5.敲低哮喘小鼠体内GRβ后PNS-R1改善Dex抑制哮喘小鼠气道损伤修复的能力明显降低。6.PNS-R1腹腔注射的小鼠与空白对照小鼠肝肾功能无差异。结论:Dex可能通过抑制GRβ表达,减少对GRα的负性调节进而抑制MAPK信号通路的激活,抑制哮喘气道上皮细胞的损伤修复。三七皂苷R1可能通过减少Dex对GRβ的抑制作用,使MAPK信号通路的激活增加,进而改善Dex抑制哮喘气道上皮损伤修复的作用。