论文部分内容阅读
植物生长发育过程中会遭受到各种生物胁迫和非生物胁迫。大丽轮枝菌（Verticillium dahlia）引发的棉花黄萎病隶属生物胁迫,阐述植物抗棉花黄萎病的作用机制是控制棉花黄萎病发生的核心所在。实验室前期研究结果表明,H2O2作为重要信号分子参与拟南芥抗大丽轮枝菌毒素（Vd-toxins）防卫反应;组蛋白 H2B 单泛素化（Histone H2B monoubiquitination,H2Bub1）作为上游调控因子参与拟南芥抗Vd-toxins防卫反应,并影响H202爆发。但目前有关H2Bub1调控该防卫反应的作用机制研究还不够深入。本论文利用拟南芥野生型和H2Bub1功能缺失突变体hub1-4,hub2-2,hub1-4 hub2-2,进一步研究H2Bub1对拟南芥抗Vd-toxins防卫反应的调控作用,重点阐述H2Bub1调控H2O2信号及信号转导途径的作用机制。研究发现,Vd-toxins处理引起H2Bub1功能缺失突变体生长明显受抑制,并伴有细胞快速死亡（programmed cell death,PCD）减弱和PR1上调表达减弱等,证明H2Bub1功能缺失引起拟南芥防卫反应减弱,H2Bub1正调控拟南芥抗Vd-toxins防卫反应。利用荧光标记法和比色法检测H2O2生成结果表明,H2Bub1突变体在Vd-toxins处理后H2O2生成量减少,生成速率减慢;进一步利用 Real-time PCR 定量检测 H2O2 生成主导基因RbohD（Respiratory burst oxidase homologue D）的表达,发现H2Bub1功能缺失抑制了 Vd-toxins诱导的RbohD上调表达。这两组实验表明H2Bub1正调控H2O2合成关键基因AtRbohD的表达,从而影响H2O2生成,参与拟南芥抗Vd-toxins防卫反应。Western blot 实验表明,MPK3（Mitogen-Activated Protein Kinase 3）和 MPK6 通过增强激酶活性参与拟南芥抗Vd-toxins防卫反应,而H2Bub1功能缺失抑制了 Vd-toxins诱导的MPK3和MPK6激酶活性增强,证明MPK3和MPK6的激酶活性受H2Bub1调控。随后以mpk3和mpk6突变体,35S:MPK3和35S:MPK6过表达以及持续激活两者活性的MKK5DD植株为材料研究了 Vd-toxins处理下MPK3和MPK6对H2O2生成的调控。利用荧光标记和DAB组织化学染色、Real-time PCR以及台盼蓝染色实验证明,Vd-toxins处理引起mpk3和mpk6突变体中H2O2生成量、RbohD基因上调幅度和细胞快速死亡程度均明显弱于野生型;而在过表达和MKK5DD植株中则呈现出与突变体相反的结果。表明MPK3和MPK6可调控RbohD转录进而参与Vd-toxins诱导的H2O2生成,影响细胞快速死亡,参与防卫反应。酵母双杂交实验证明,酪氨酸磷酸酶PTP1（Protein Tyrosine Phosphatase 1）和MKP1（MAP Kinase Phosphatase 1）与MAPK3和MPK6有互作。随后的实验证明PTP1和MKP1负调控MPK3和MPK6激酶活性。利用ptp1和mkp1突变体以及35S:PTP1和35S:MKP1过表达植株检测Vd-toxins 处理后 H2O2 生成、RbohD基因表达以及细胞快速死亡的结果表明,在 35S:PTP1和35S:MKP1过表达植株中,H2O2生成、RbohD基因表达和细胞快速死亡被诱导程度均明显弱于野生型,与mpk3和mpk6突变体中的结果趋势一致;而ptp1和mkp1突变体则与野生型相似,与35S:MPK3和35S:MPK6过表达以及MKK5DD植株中的结果趋势一致。这从另一层面佐证了 MPK3和MPK6在H2O2生成中的功能。酵母单杂交和烟草GUS/LUC酶活检测系统实验表明,WRKY33可结合RbohD启动子区并促进RbohD表达。已知MPK3和MPK6可以磷酸化WRKY33而增强其结合目的基因启动子区域的能力,说明MPK3和MPK6极有可能通过磷酸化WRKY33来调控RbohD基因表达和H2O2生成,从而参与拟南芥抗Vd-toxins防卫反应。综上,H2O2信号是拟南芥抗Vd-toxins防卫反应中的重要信号途径,H2Bub1直接调控H2O2生成关键基因NADPH氧化酶AtRbohD的表达,影响H2O2生成;同时,H2Bub1通过调控MPK3和MPK6激酶活性,有可能通过调控WRKY33转录因子的结合活性,间接影响H2O2生成。H2Bub1通过H2O2介导的信号途径调控拟南芥抗Vd-toxins的防卫反应。本研究为阐明H2Bub1参与拟南芥抗Vd-toxins的防卫反应的分子机理提供新的理论依据,从新的角度揭示了拟南芥抗Vd-toxins防卫反应H2O2信号通路的调控机制,为植物抗黄萎病的防御机制研究提供理论基础。