研究背景和目的原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是世界范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其主要类型为肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC),所占比例约为85%-90%。全球每年大约有100万人被确诊为肝癌,且发病率呈逐渐上升趋势,肝癌死亡率在全世界恶性肿瘤中居第三位。中国是全世界肝癌发病集中的国家,每年新发病例约占全球的50%。根据最新的肿瘤登记报告显示,我国肝癌发病率为26.39/105,在所有恶性肿瘤中居第4位(10.54%),而其死亡率为23.93/105,在所有癌症死亡中居第2位(15.26%),仅次于肺癌。随着预防措施、检查手段、治疗方法的不断发展、提高,肝癌病死率有所下降,但仍旧不理想。这是由于在肝癌早期,临床症状不明显,加之病情发展迅速,难以实现早期诊断和及时有效地治疗,大多数患者在发现肝癌时已处于癌症晚期,有肝内或其他部位的转移,即使采取根治性切除,5年复发转移率仍高达60%-70%。由此可知,肝癌在世界范围内严重威胁着人类的健康安全,而治疗肝癌、提高整体疗效的关键在于尽早发现、预防其复发、转移。因此,全面研究肝癌复发、转移过程中的分子机制,探索能够有效评估肝癌复发、转移风险的预测指标和提高肝癌的早诊率是改善肝癌患者预后的重点和难点。IL-11是一种具有多重生物学功能的细胞因子,属于IL-6细胞因子家族中的一员。已有研究表明IL-11在造血系统及非造血系统中均发挥重要作用,包括促进红细胞生成,促进血小板生成,调节骨代谢,肠粘膜保护等功能。IL-11通过结合细胞膜上特异性的IL-11RA,再与gp130形成复合体,激活细胞内下游的信号通路,从而影响细胞功能,在多种炎症性疾病和肿瘤的发生发展中起着重要作用。受体复合物活化后可以激活细胞内信号通路,引起细胞形态及功能发生变化,其中主要有三条信号通路:信号传导及转录激活因子磷酸化途径(signal transducer and activator of transcription,STAT),丝裂原活化蛋白激酶级联磷酸化反应(ras-mitogen activated protein kinase,MAPK)和磷酸肌醇-3 激酶活化(phosphotidylinosito l-3 kinase,PI-3K)。有研究已证实 IL-11 及其特异性受体IL-11受体α链(IL-11RA)在子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌、直肠癌等肿瘤中均有高表达。Lay等发现IL-11可通过STAT3途径促进子宫内膜癌细胞粘附及转移能力,应用STAT3通路抑制剂可以逆转IL-11对侵袭能力的影响,另外发现IL-11对其增殖能力无明显影响。也有学者发现IL-11不仅通过PI3K途径促进结肠癌细胞浸润转移,并能提高肠癌细胞的增殖能力。有研究表明IL-11在促进乳腺癌骨转移过程中可能与MAPK途径相关。目前已有研究发现,IL-11在肝癌组织中高表达,并有可能成为判断肝癌不良预后的独立危险因素。然而,IL-11在肝癌浸润发展过程中作用的机制尚不清楚。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),是指上皮细胞发生间质细胞样改变,由原来连接紧密、不能运动的上皮细胞向连接疏松、具有迁移活动能力的间质细胞转化的过程,即上皮细胞间的极性和细胞间紧密连接、粘附的丧失,间质表型表型出现,广泛参与人体的病理生理过程。近几年来,已有大量研究在多种恶性肿瘤中发现EMT与肿瘤细胞浸润、转移有着密切关系。Alonso SR等研究发现在原发性黑色素瘤中,EMT目关基因的显著表达使肿瘤细胞更具浸润、转移能力。Blanco MJ等发现EMT的发生与乳腺癌分化程度及淋巴转移密切相关。EMT与肝癌的研究中表明肝癌组织中高表达的STAT5b可能通过诱导EMT的发生从而促进肝癌进展。肿瘤细胞EMT的发生被证实与许多因素相关,包括上皮表型蛋白表达的减少或丢失、转录因子表达上调、细胞内信号通路活化等。EMT分子标志物的主要特征有:上皮标志物表达减少或缺失(包括E-钙黏蛋白、整合素等表达下调)和间质细胞标志物表达增加(包括Vimentin、纤连蛋白、N-钙黏蛋白表达上调)。目前已有研究表明EMT参与肝癌的进展并与肿瘤转移及不良预后相关。然而,肝癌EMT现象的发生的具体机制还不清楚。本实验将探讨IL-11是否与肝癌的发生相关并对其在肝癌浸润、转移过程中的作用及其相关机制进行研究。方法1、临床病理标本收集:收集原发性肝癌患者肝癌组织及其癌旁组织的病理标本,进行免疫组织化学检测,结合临床病理资料及检测结果,分析IL-11、IL-11受体在肝癌组织中的表达情况。2、肝癌SMMC7721细胞的培养。用含10%的胎牛血清、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素的高糖DMEM培养基培养于37℃、5%CO2环境中。3、细胞增殖、迁移实验:采用CCK-8法检测thIL-11对肝癌细胞增殖能力的影响;采用划痕试验及Transwell小室迁移试验检测thIL-11对细胞迁移能力的影响。4、实时荧光定量 PCR 反应(Quantitative Realtime PCR,QRT-PCR):检测rhIL-11对肝癌细胞EMT标志性分子E-cadherin和Vimentin的mRNA表达情况的影响。按说明书进行操作,提取细胞总RNA并检测RNA浓度和纯度、逆转录合成cDNA和PCR反应。扩增后得到相关数据和曲线,按相对定量2-ΔΔα法分析得出结果。5、免疫蛋白质印迹(Westen Blot):检测rhIL-11对肝癌细胞EMT标志性分子E-cadherin和Vimentin的蛋白表达情况的影响。并检测rhIL-11对肝癌细胞STAT3、AKT、ERK蛋白磷酸化水平的影响。按步骤提取细胞总蛋白,测定蛋白浓度,电泳,转膜,免疫反应,曝光显影并分析结果。6、免疫荧光(Immunofluorescence,IF):检测rhIL-11对肝癌EMT标志分子E-cadherin和Vimentin的蛋白表达情况的影响。7、数据统计:数据统计分析采用SPSS13.0软件,所有计量资料均表示为均数±标准差(±s)。两组样本间比较采用两样本的t检验;多组样本间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA);需先进行方差齐性检验,如方差齐,则选用Bonferroni法作样本间的多重比较;如方差不齐,则采用Dunnett T3法作样本间的多重比较。定性变量采用Pearson χ2检验或Fisher确切概率法。P0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.IL-11和IL-11受体在肝癌组织中的表达。在肝癌组织中,IL-11及IL-11RA表达明显高于癌旁正常组织,且通过与临床病理资料分析发现,肝癌组织中IL-11的表达与肝癌分化程度、淋巴结转移、门静脉癌栓形成相关,而IL-11RA的表达与肝癌分化程度及门静脉癌栓形成相关。2.rhIL-11对肝癌细胞增殖、迁移能力的影响。细胞增殖试验(CCK-8法)检测显示rhIL-11刺激肝癌细胞后对细胞生长较未刺激时无明显差异。划痕试验显示rhIL-11刺激肝癌细胞后划痕宽度接愈合,较对照组明显缩窄,创伤愈合度差异明显。Transwell小室迁移试验显示rhIL-11刺激肝癌细胞后,侵入下室的细胞较对照组明显增多。3.QRT-PCR检测rhIL-11对肝癌细胞EMT标志性分子E-cadherin和Vimentin的mRNA表达的影响。经thIL-11刺激后,肝癌细胞E-cadherin的mRNA表达量较未刺激时减少;而Vimentin的mRNA表达量较未刺激时增多。4.Western Blot检测rhIL-11对肝癌细胞EMT标志性分子E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响。与基因水平一直的是,经rhIL-11刺激后,肝癌细胞E-cadherin的蛋白表达量较未刺激时减少;而Vimentin的mRNA表达量较未刺激时增多。5.免疫荧光检测rhIL-11对肝癌细胞EMT标志性分子E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响。与前面实验基本一致,即经rhIL-11刺激后,肝癌细胞E--cadherin的蛋白表达量呈下降趋势;而Vimentin的蛋白表达量呈上升趋势。6.Western Blot 检测 rhIL-11对肝癌细胞 STAT3、AKT、ERK蛋白磷酸化水平的影响。rhIL-11刺激肝癌细胞后,细胞内p-STAT3、p-AKT表达增加,且p-STAT3在刺激10分钟时表达增加最明显,p-AKT在刺激30分钟时表达量增加最明显。而p-ERK1/2在未被rhIL-11刺激的肝癌细胞中有表达,且经rhIL-11刺激后表达量无明显变化。7.阻断PI3K/AKT、JAK/STAT3信号通路对rhIL-11促进肝癌细胞迁移能力的影响。分别应用LY294002(PI3K抑制剂)和S31-201(STAT3抑制剂)阻断PI3K/AKT、JAK/STAT3信号通路后,Transwell小室试验中侵入下室的细胞数较rhIL-11刺激组均明显减少。结论本研究发现IL-11及IL-11RA在肝癌组织中高表达,联合应用肝癌分化程度、门静脉癌栓形成等临床病理指标有助于HCC患者病情判断。虽然IL-11对肝癌细胞的增殖能力无明显影响,但可以提高肝癌细胞的迁移能力,可能为肝癌浸润转移的机制之一。IL-11可在基因水平及蛋白水平下调肝癌细胞EMT标志性分子E-cadherin的表达并上调Vimentin的表达,提示IL-11可能诱导肝癌细胞EMT的发生。此外IL-11可以使STAT3和AKT磷酸化水平升高,且STAT3信号通路抑制剂和PI3K信号通路抑制剂均可减弱IL-11对肝癌细胞迁移能力的影响,提示IL-11可能通过或部分通过激活JAK/STAT3信号通路和PI3K/AKT信号通路促进肝癌细胞浸润及转移。本研究旨在探讨IL-11促进肝癌细胞浸润转移的机制,可为全面了解肝癌浸润及转移的生物学行为,有效预测肝癌浸润转移的风险及研发肝癌特异性靶向治疗药物提供了理论基础。