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第一部分：生物钟CLOCK蛋白对动脉粥样硬化相关基因的转录调控作用目的：研究生物钟CLOCK蛋白可与哪些动脉粥样硬化相关基因启动子区域的标准E-box或E-box-like元件结合,确定哪些动脉粥样硬化相关基因属于钟控基因(clock controlled genes, ccgs)。方法：1.在PubMed中查找分析动脉粥样硬化相关基因上游-2kb启动子区域的E-box或E-box-like元件,采用染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation, ChIP),确定哪些动脉粥样硬化相关基因可能受到CLOCK蛋白的转录调控,属于钟控基因。Ⅳ胶原酶灌注法培养原代C57BL/6J、鼠肝细胞。2.合成小鼠clock基因小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)及构建小鼠clock基因过表达腺病毒载体,分别转染C57BL/6J小鼠肝细胞,48小时后,通过Realtime PCR测定clock基因抑制或过表达后,动脉粥样硬化相关基因(ChIP实验筛选出的CLOCK蛋白的靶基因)的mRNA表达水平变化。3.原代培养CLOCK mutant、鼠和C57BL/6J、鼠肝细胞,通过Realtime PCR测定动脉粥样硬化相关基因(ChIP实验筛选出的CLOCK蛋白的靶基因)mRNA表达水平变化。结果：1.通过ChIP证实CLOCK蛋白与LIF (leukemia inhibitory factor)、ICAM-1、 ADFP(adipose differentiation-related protein)、NF-κB1基因(编码p105NF-κB亚单位)启动子的结合能力分别是阴性对照组的2.58倍、3.48倍、2.45倍、2.27倍。2.与negative-control siRNA组相比,C57BL/6J小鼠肝细胞转染clock-siRNA48小时后clock基因mRNA表达水平下降81%,LIF、NF-κB1、ADFP、ICAM-1的mRNA表达水平均下降,分别下降31.6%、40.5%、10%、41.8%。与GFP对照组相比,小鼠clock过表达腺病毒感染C57BL/6J小鼠肝细胞48小时后,clock基因mRNA表达水平增加201倍,ADFP、ICAM-1基因mRNA表达水平分别增加2.03倍、2.81倍；LIF、NF-κB1基因的mRNA表达水平变化不明显。3.与C57BL/6J小鼠相比,CLOCK mutant小鼠肝细胞中LIF.NF-κB1、ADFP、 ICAM-1的mRNA表达水平显著下降,分别下降46.9%、52%、16.7%、45.7%。结论：1.首次证实生物钟CLOCK蛋白可与动脉粥样硬化相关基因LIF、NF-κB1、 ADFP、ICAM-1基因含有E-box或E-box-like元件的启动子序列结合。2.抑制小鼠肝细胞clock基因表达以及CLOCK mutant小鼠肝细胞中,LIF、NF-κB1、ADFP、ICAM-1的mRNA表达水平明显下降。3.提示LIF、NF-κB1、ADFP、ICAM-1基因可能是钟控基因。第二部分：生物钟CLOCK蛋白对ICAM-1基因转录调控作用及对小鼠内皮细胞粘附功能的影响目的：明确生物钟CLOCK蛋白对ICAM-1基因的转录调控作用,探讨CLOCK对小鼠内皮细胞粘附功能的影响。方法：1.利用pGL3-Promoter Luciferase Reporter Vector,构建小鼠ICAM-1基因含有E-box-like元件(CAAGTG,from-584to-579)的启动子序列(from-729to-329)报告基因。小鼠ICAM-1报告基因重组质粒与clock-siRNA或negative control siRNA共转染C57BL/6J、鼠肝细胞,48小时后测定荧光素酶活性。2.将clock-siRNA或negative control-siRNA转染至小鼠脑血管内皮细胞bEnd.3细胞,24小时后,通过Realtime PCR测定clock基因表达下调后动脉粥样硬化相关基因(ChIP筛选出的CLOCK蛋白的靶基因)的mRNA表达水平变化。3.将clock-siRNA或negative control siRNA转染bEnd.3细胞。48小时后,以细胞粘附试验测定clock基因表达下调后bEnd.3细胞粘附功能的改变,并通过Realtime PCR测定粘附相关基因mRNA表达水平变化。结果：1.成功构建小鼠ICAM-1基因含有E-box-like元件的启动子序列报告基因。小鼠ICAM-1报告基因重组质粒与clock-siRNA或共转染C57BL/6J小鼠肝细胞,与negative control siRNA组相比,clock基因表达下调后荧光素酶活性下降61.5%。2.与negative control siRNA组相比,Clock-siRNA转染bEnd.3细胞24小时后,clock基因nnRNA表达水平下降54.33%, ICAM-1、LIF、NF-κB1、ADFP的1nRNA表达水平均下降,分别下降34.43%、38%、26%、8%。3.与negative control siRNA组相比,Clock-siRNA转染bEnd.3细胞48小时后,细胞粘附功能下降41.7%,粘附相关基因VCAM-1、CCL-2、CCL-5的nRNA表达水平分别下降21.7%、27.4%、19%。结论：1.首次证实生物钟CLOCK蛋白可调节ICAM-1基因的转录活性和转录水平。2. Clock基因表达抑制后小鼠内皮细胞粘附功能显著下降,粘附相关基因的mRNA表达水平下降,提示生物钟clock基因可能通过调节细胞粘附功能而影响动脉粥样硬化发生发展。