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研究背景急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫症(ARDS)严重威胁着人民的生命安全。严重的感染(如脓毒症)是引起ALI/ARDS主要原因之一。尽管目前对ALI/ARDS的研究取得了一定进展,但仍无有效的药物及治疗措施,其死亡率仍居高不下。因此深入探究ALI/ARDS炎症反应机制寻找新的ALI/ARDS的防治靶点显得尤为重要和迫切。国内外研究表明在急性肺损伤发生、发展过程中肺泡巨噬细胞发挥着重要作用。因此,深入研究巨噬细胞在这一过程中的作用有望为ALI/ARDS的防治提供新策略、手段。核受体协同抑制因子(nuclear receptor corepressor,NCOR)是一种核转录抑制因子。研究显示NCo R可通过TLR4信号转导或抑制NF-κB和AP-1调节炎症。但NCOR如何被调控,其机制尚不清楚。DNA甲基化是高等真核生物基因组中的主要表观遗传修饰,其在DNA甲基转移酶(DNMTs)催化下参与基因调控从而引起疾病的发生发展。本课题拟采用脂多糖(LPS)诱发的巨噬细胞炎症模型,探讨NCOR在炎症反应中的作用及其调控机制。研究目的:1.阐明NCOR在LPS诱导炎症反应中的作用;2.探讨NCOR启动子甲基化的机制以及在炎症反应中的作用。研究方法:1.LPS刺激巨噬细胞对NCOR的表达及炎症的影响用1ug/ml的LPS分别处理小鼠巨噬细胞RAW264.7 24h和48h,Western blot检测NCOR蛋白的表达水平,Real time-PCR检测NCOR、TNF-α、IL-6 mRNA水平。荧光素酶报告基因检测NF-κB启动子活性。2.LPS刺激巨噬细胞对NCOR基因启动子甲基化的影响LPS刺激细胞48h后,应用MSP检测NCOR启动子甲基化情况,Western blot检测DNMT3b的表达变化。Real time-PCR检测5’-aza和LPS联合处理细胞后NCOR mRNA的表达水平。3.下调DNMT3b对NCOR及炎症的影响巨噬细胞转染DNMT3b siRNA后,再用LPS处理巨噬细胞,分别应用Western blot和Real time-PCR检测DNMT3b的表达水平,以及DNMT3b siRNA和LPS联合作用下NCOR、TNF-α、IL-6的表达水平和NF-κB的启动子活性。结果:1.LPS刺激细胞24、48h后,NCOR蛋白和mRNA表达显著下调(p<0.05);同时炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA表达水平、NF-κB的启动子活性显著上升(p<0.05)。2.LPS可诱导NCOR启动子发生甲基化,DNMT3b蛋白的表达水平升高,用5’-aza和LPS联合处理细胞后NCOR mRNA水平较LPS组有显著上升(p<0.05)。3.DNMT3b siRNA可显著下调DNMT3b蛋白和mRNA水平,升高NCOR表达水平,从而抑制TNF-α、IL-6的表达水平和NF-κB的启动子活性(p<0.05)。结论:1.LPS刺激巨噬细胞引起NCOR表达水平降低,促进炎症。2.LPS通过DNMT3b介导NCOR的启动子甲基化上调巨噬细胞炎症反应。3.下调DNMT3b表达可通过降低NCOR启动子甲基化水平进而抑制巨噬细胞炎症反应。