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基因转移载体有很多种,各有特色,其中腺病毒载体(Adenovector, Ad)由于感染细胞类型广、感染效率高、既能感染分裂期也能感染非分裂期细胞、不整合入细胞基因组(遗传毒性较低)、容易制备高滴度病毒、理化性质稳定等优点被广泛用于肿瘤的基因治疗。然而常用的5型腺病毒(Ad5)载体对造血细胞感染效率很低,限制了它在白血病基因修饰瘤苗中的应用。腺病毒主要是通过其五邻体的纤维(Fiber)识别细胞表面的腺病毒受体进入细胞,不同血清型腺病毒的细胞靶向性可能不同,对Fiber进行结构改造或血清型替换将改变腺病毒的靶向性。为了提高Ad5对造血细胞的感染效率,本实验室前期工作对Ad5载体的纤维顶球进行了改造,将其替换为B组11p型腺病毒(Adllp)的纤维顶球,得到的Ad5F11p载体靶向性发生了改变,其对造血细胞的感染效率有了较大提高(约为Ad5的10倍),但对原代白血病细胞(尤其是淋巴系白血病细胞)的感染效率仍然较低。近年来的研究表明基于甲病毒(alphavirus)的病毒载体或复制子(replicon)能高效地在哺乳动物细胞表达外源基因,在疫苗制备中已经得到广泛应用。甲病毒高效表达外源基因的原因是其在转录水平调控产生了大量外源基因的mRNA。但甲病毒难以进入造血细胞。如果将Ad5F11p载体的造血细胞靶向性与甲病毒高效转录的特点相结合,有可能进一步提高外源基因在造血细胞的表达水平。基于上述原因,本课题拟将腺病毒与甲病毒结合起来,构建杂合病毒载体,并评价其对造血细胞的感染情况。实验的基本构想如下：在Ad5F11p载体的多克隆位点处,插入甲病毒复制子载体序列(包括5’的非结构蛋白序列、亚基因组复制起始位点、目的基因)。得到杂合病毒载体能按照腺病毒的方法进行包装、制备和纯化,得到的病毒具有腺病毒的外壳,感染细胞时,Ad5F11p的纤维与造血细胞上的受体结合,病毒进入细胞,其杂合子基因组进入细胞核,在启动子的启动下,甲病毒载体序列被转录成RNA,进入细胞浆,非结构蛋白表达,继而亚基因组mRNA大量合成,目的基因表达。本实验重组腺病毒的制备方法类似于AdEasy系统,其构建策略为在穿梭质粒的多克隆位点处插入目的DNA序列,通过穿梭质粒和骨架质粒在细菌细胞中同源重组,获得含病毒基因组的质粒,质粒线性化后,转染包装细胞产生重组病毒。首先,进行杂合病毒基因组质粒的构建,基本实验过程包括骨架质粒构建、穿梭质粒构建、同源重组产生杂合病毒基因组。具体步骤如下：(1)构建腺病毒骨架质粒pAdEasy-1/F11p-E4orf3。由于拟插入的甲病毒元件和目的基因序列超过了腺病毒载体的包装容量,需对腺病毒骨架质粒(pAdEasy-1/f11p)继续改造,通过删除部分区域扩大腺病毒容量。从质粒pAdEasy-1/f11p(约32.7 kb)分离得到一个小的中间体质粒pFiber5/11p(约8.9 kb),利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除,将改造后的中间体质粒复原到原骨架质粒的相应位置,得到新的骨架质粒pAdEasy-1/F11p-E4orf3.这样重组腺病毒的载量增大到约10 kb。(2)构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。杂合穿梭质粒的基本构建策略是在pShuttle质粒的多克隆位点处插入造血细胞特异性启动子(CD11a promoter, CD11Ap)、甲病毒载体元件(nsP1-4)、目的基因(GFP)、PolyA加尾信号。先利用PCR、酶切连接等分子生物学方法,在甲病毒复制子质粒pSFV1非结构蛋白nsP1-4基因上游添加启动子CD11Ap,得到了pSFV1-cd11a;再在pSFV1-cd11a多克隆位点(MCS)下游引入SV40 polyA加尾信号,得到pSFV1-cd11a-polyA;然后选择合适的酶切位点(BamHI)将GFP基因亚克隆至质粒多克隆位点得到pSFV1-cd11a-polyA-GFP。由于pShuttle质粒的多克隆位点没有适宜的酶切位点用于亚克隆CD 11 Ap-nsP-GFP-polyA元件,故删除pShuttle原有多克隆位点,并引入识别8位核苷酸序列的限制性内切酶AscI的位点(GGCGCGCC),得到pShuttle-AscI o用AscI酶切pSFV1-cd11a-polyA,回收CD11 Ap-nsP-GFP-polyA元件,插入pShuttle-AscI的AscI位点,构建得到杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。(3)杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP经PmeD线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1/F11p-E4orf3共转化BJ5183感受态细胞,同源重组获得杂合病毒质粒pAdE4orf3-SFV-GFP。(4)另外,我们构建了重组腺病毒质粒pAdE4orf3-GFP,其不含有甲病毒元件,用作pAdE4orf3-SFV-GFP的对照。杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增需要辅助病毒的辅助作用,为此,又构建了Fiber改造的新型靶向辅助病毒Ad5/f11p-HV。辅助病毒制备过程包括穿梭质粒改造、辅助病毒基因组制备、辅助病毒拯救和纯化。重新设计两端含有loxP序列的不完全包装信号,意在减弱辅助病毒的包装效率和能够在Cre4细胞中有效的得到剪切提高目的病毒的产量。在靶向造血细胞骨架质粒AdEasy-1/f11p的基础上构建了可包装B组F11p型部分纤维(fiber)基因的新型辅助病毒pAd5/f11p-HV。(1)设计8条引物,通过重叠延伸PCR合成大小为241bp含有酶切位点和loxP序列的包装信号DNA片段,替换pShuttle原有的包装信号,构建了穿梭质粒pShuttle-SynES;(2)穿梭质粒pShuttle-SynES与骨架质粒AdEasy-1/f11p在BJ5183感受态细胞中同源重组获得重组腺病毒质粒pAd5/f11p-HV; (3)pAd5/f11p-HV质粒经Pad酶切线性化后转染293细胞,包装出辅助病毒Ad5/f11p-HV,对其进行扩增培养,CsC1密度梯度离心法得到纯化的Ad5/f11p-HV辅助腺病毒。最后,利用Ad5/f11p-HV进行杂合病毒拯救,然后进行了扩增纯化、杂合病毒的基因转移效率评价。pAd5/f11p-HV和pAdE4orf3-SFV-GFP线性化后,双质粒共转染293细胞,拯救出AdE4orf3-SFV-GFP病毒。杂合病毒大量扩增后通过CsCl密度梯度离心法得到纯化的AdE4orf3-SFV-GFP,通过TCID50方法测得感染滴度为1.5×1010IU／ml。分别采用10MOI、50MOI、100MOI、和200MOI的杂合病毒AdE4orf3-SFV-GFP、5型腺病毒Ad5-GFP(对照1)及改构的5型腺病毒Ad5/F11P-GFP(对照2)在体外对白血病细胞系K562、U937、U266、SKO-007进行感染,通过流式细胞术评价感染效率。结果表明,与Ad5-GFP相比,AdE4orf3-SFV-GFP对造血细胞的的感染效率有了明显的提高,而与Ad5/F11P-GFP感染效率相似,但是目的基因表达增强。例如,分别采用100MOI的AdE4orf3-SFV-GFP和Ad5/F11P-GFP感染K562细胞24h,感染效率分别为64.65%±4.57%和77.36%±6.36%,而Ad5GFP的感染效率为22.98%±2.23%。综上所述,本研究成功制备了靶向型可包装B组F11p型部分纤维(fiber)的新型辅助病毒Ad5/f11p-HV,并制备了腺病毒-甲病毒杂合病毒AdE4orf3-SFV-GFP。该杂合病毒对造血细胞系的感染效率与常用的腺病毒Ad5-GFP相比明显提高,与Ad5/F11P-GFP相比也有提高,且目的基因表达明显增强。我们的工作为进一步研究腺病毒-甲病毒杂合病毒载体对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。