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背景:难愈合性糖尿病皮肤创口（diabetic skin wound,DSW）是糖尿病患者的严重并发症之一,是由于糖尿病患者由于体内糖代谢紊乱,当皮肤出现创口时无法正常自愈,甚至不愈合。目前研究表明,高糖环境能够抑制成纤维细胞和血管内皮细胞功能,抑制成纤维细胞会导致胶原沉积减慢甚至停滞,创口重建减缓。抑制血管内皮细胞会导致血管生成减少,创口处供血供氧减少,导致DSW难以愈合。而目前临床治疗中主要以清创和控制感染为主,无法有效恢复成纤维细胞和血管内皮细胞的功能,治疗效果较差。近年来,随着再生医学不断发展,外泌体治疗法用于DSW在动物模型中均取得了良好的治疗效果,外泌体（Exosomes,Exo）相较于间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）有更小的尺寸、更低的免疫原性,而且能够避免伦理道德问题,是未来最有希望应用于临床治疗的方法之一。但是由于Exo中存在多种生物活性物质,促进创口愈合的机制较为复杂,涉及多种通路和机制,这限制了外泌体疗法的更广阔的应用。因此为了探究Exo是否能够在DSW的高糖环境中恢复对成纤维细胞和血管内皮细胞的功能,因此本研究选用来源广泛,培养简单,扩增迅速的人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,HucMSC）作为提取Exo的细胞来源,以人成纤维细胞（human fibroblast,HFB）和人血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）作为体外实验所用细胞系,用30m M和60m M的高糖培养基中模拟DSW中的环境,测定Exo对HFB和HUVEC的作用,以此探究Exo在DSW中的作用。目的:以HFB和HUVEC作为实验细胞系,探究HucMSC-Exo在30m M和60m M高糖状态下对HFB和HUVEC的影响,进而了解HucMSC-Exo在不同浓度下通过对HFB和HUVEC的细胞功能的作用方式。并通过建立DSW模型,探究Exo对DSW处胶原沉积和血管形成的影响。方法:表征实验:首先检测通过流式细胞术和三系分化实验检测HucMSC的多向分化能力和表面标志物。然后提取HucMSC-Exo,通过Western Blot检测外泌体的表面标志物,并且通过纳米颗粒跟踪分析仪检测其大小、透射电子显微镜检测其大小和形态。体外实验:选取HFB和HUVEC作为体外实验中的细胞系,在培养基中加入葡萄糖建立30m M组和60m M组模拟高血糖环境,通过CCK-8实验、细胞克隆形成实验检测HFB和HUVEC的增殖能力,Transwell迁移实验、划痕实验检测HFB和HUVEC的迁移能力,小管形成实验检测HUVEC的小管形成能力,随后加入HucMSC-Exo干预,通过上述实验测定HucMSC-Exo对30m M和60m M高血糖状态下的HFB和HUVEC的增殖、迁移的影响,对HUVEC的小管形成能力的影响。体内实验:通过腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）构建2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）大鼠模型,然后在构建完成的糖尿病大鼠背部切除直径为1.5cm的全层皮肤,构建DSW模型。将成功构建DSW的大鼠模型随机分成三组,分别为:PBS组、HucMSC治疗组、HucMSC-Exo治疗组。采集0、1、2周的伤口愈合照片。治疗两周后将大鼠处死,留取皮肤伤口进行分析。通过HE染色、Masson染色和CD31免疫组化等实验,检测大鼠伤口的愈合程度、胶原沉积量和血管生成量,评估愈合效果。结果:首先提取HucMSC后进行三系分化实验和表面标志物,根据国际干细胞鉴定方法确定HucMSC提取成功,然后通过超速离心法提取HucMSC-Exo,通过电镜分析和粒径分析,证明HucMSC-Exo形态经典,大小均一,可用于本研究中使用。通过体外实验证明,高糖状态下HFB和HUVEC的增殖、迁移能力以及HUVEC的小管形成能力均被不同程度抑制,并且随着葡萄糖浓度的增加,抑制作用不断增强。在高糖状态下加入HucMSC-Exo干预后HUVEC和HFB细胞的增殖、迁移能力以及HUVEC的小管形成能力不同程度有所恢复,表明HucMSC-Exo在不同血糖浓度下均能够有效恢复HFB和HUVEC在高糖状态下被抑制的细胞功能。在体内的验证实验的中表明HucMSC-Exo对DSW的治疗效果最好,伤口愈合程度、胶原沉积量、血管生成量均有所提升,证明HucMSCExo可以促进成纤维细胞的增殖、迁移能力以胶原生成,促进血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力以促进血管生成,最终促进DSW愈合。结论:HucMSC提取成功,具有干细胞的各种特性。选择状态良好的细胞提取HucMSC-Exo,经过检查,HucMSC-Exo大小、形态和表面标志物均符合Exo的基本要求,故HucMSC-Exo提取成功。HucMSC-Exo通过提高HUVEC和HFB细胞在高血糖环境下的增殖、迁移、成管能力,从而促进DSW的愈合。同时通过统计分析可得,相较于30m M的浓度下,在60m M的浓度下HucMSC-Exo对HFB的增殖、迁移能力减弱,而对HUVEC作用下,HucMSC-Exo能够发挥更好的促进增殖和迁移功能,同时成管能力减弱。这一现象表明,HucMSC-Exo在不同血糖浓度下发挥作用不同,提示在不同血糖浓度下使用不同的治疗方法。在体内实验的验证中,结果与体内实验相似,经过HucMSC-Exo治疗后的DSW胶原沉积和血管生成较对照组都有所增加。