研究背景随着人们饮食结构的改变和肥胖率的增加,糖尿病（diabetes,DM）的发病率日益增高。流行病学调查显示,糖尿病患者中动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的发生率和严重性远高于非糖尿病患者,而AS是冠心病等心血管疾病的主要病理基础,故深入研究糖尿病加速AS发生发展的具体机制,寻找有效的预防和治疗方法至关重要。正常血管壁中的平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）只存在于动脉中膜中,以收缩型为主,其增殖速度很慢。糖尿病状态下,高糖、活性氧等刺激损伤血管内皮,内皮细胞、炎性细胞和血小板等释放大量生长因子和趋化因子,使VSMCs从生长抑制中得以释放;同时上述细胞还能分泌大量基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）,后者催化细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解,促使VSMCs从中膜迁移至内膜。迁移到内膜层的VSMCs可分泌多种粘附分子和趋化因子,促使单核巨噬细胞浸润和泡沫细胞的形成。因而,VSMCs增殖和迁移是糖尿病AS斑块形成的中心环节。细胞周期作为增殖信号级联反应的最终途径,被各种有丝分裂刺激所共享。细胞周期分为有丝分裂间期（G1期、S期和G2期）和有丝分裂期（M期）,其中的各个检查点均有相应的细胞周期蛋白（cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases,CDK）及其抑制剂（CDK inhibitor,CDKI）对其进行调控。血管损伤后,VSMCs响应有丝分裂原刺激从G1期进入S期;其中cyclinD1-CDK4和cyclinE-CDK2在这一转换期间按序发挥作用,是这一时期的细胞周期进程所必需的。许多药剂,包括抗VSMCs增殖剂,以及抗血栓和抗血小板剂,可以改变细胞周期中的一个或多个调节事件,导致细胞周期进程的阻断,从而抑制细胞增殖。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly（ADP-ribose）polymerase,PARP）-1 是 PARP家族最主要的亚型,发挥了 90%的PARP活性。PARP-1通过催化自身和其他染色质相关蛋白的多聚二磷酸腺苷核糖（poly（ADP-ribosyl）ation,PARylation）化来修复DNA。此外,PARP-1涉及多种细胞功能,包括基因转录调控、细胞周期进展、炎症、能量代谢和细胞迁移。糖尿病状态下,氧化应激、亚硝酸盐等损伤DNA,PARP-1能够识别DNA单链或双链损伤并被激活。先前一系列研究已证实PARP-1在糖尿病心肌病、肾病、视网膜病及神经系统损害中的重要作用,然而其在糖尿病加速血管内膜增生中的作用尚未阐明。研究目的1.观察高糖刺激对人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）中PARP-1表达的影响;2.研究PARP-1在高糖诱导的HASMCs增殖和迁移中的作用;3.研究PARP-1在糖尿病血管内膜增生中的作用。研究方法1.HASMCs的培养及分组用含2%FBS的SMCM培养基对HASMCs进行体外培养,置于5%CO2,37℃孵育箱。分组一:根据高糖不同刺激时间进行分组:0小时、24小时、72小时、5天;分组二:正常对照组（NC,5.5 mM葡萄糖）、高渗对照组（OC,5.5 mM葡萄糖+27.5 mM甘露醇）、高糖刺激组（HG,33 mM葡萄糖）、高糖+PARP-1抑制剂组（HG+PJ34,33 mM葡萄糖+5μM PJ34）;刺激72小时后收集细胞和培养基。2.HASMCs增殖检测用Cell-LightTMEdU方法检测细胞的增殖情况。3.流式细胞术检测收集干预后的细胞,碘化丙啶（propidiumiodide,PI）染色,利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。4.HASMCs迁移检测用Transwell小室法检测细胞的迁移情况。5.明胶酶谱检测用明胶酶谱法检测各组HASMCs上清液中MMP2和MMP9的活性。6.蛋白质印迹法（Western Blot）提取不同干预组HASMCs的蛋白,采用Western Blot方法检测PARP1、PAR、MMP2、MMP9及PCNA在蛋白水平的变化,以β-actin为内参照蛋白。7.实验动物模型构建和组织获取实验动物对象为C57BL/6小鼠和C57BL/6/PARP-1基因敲除小鼠,均为8周龄、雄性、体重约25 g。将10只C57BL/6小鼠和10只C57BL/6/PARP-1-/-小鼠腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）,剂量为 50mg/kg/d,另外 10只C57BL/6小鼠腹腔注射等体积的柠檬酸盐缓冲液作为对照组,连续注射5天。2周后检测随机血糖值,大于16.7 mmol/l为1型糖尿病造模成功。最终实验动物分组如下:正常对照组、糖尿病C57BL/6小鼠组、糖尿病PARP-1-/-小鼠组。造模成功后,糖尿病和非糖尿病小鼠均行左侧颈总动脉结扎手术,术后3周取材。剥离整根主动脉包括左侧颈总动脉,放入4%多聚甲醛中固定,流水冲洗后进行石蜡包埋和切片。8.人体血管组织获取和分组与本院移植中心合作,收集人体冠状动脉各分支。查看患者资料,排除恶性肿瘤、急性炎症性疾病与风湿等系统疾病患者的组织。临床血管标本获取后,迅速放入4%多聚甲醛中,固定24小时后流水冲洗过夜,切取左冠状动脉回旋支远段部分5 mm段进行石蜡包埋和切片。显微镜下观察,根据血管内膜有无增生将组织分为正常组和增生组。9.组织形态及免疫组织染色对石蜡切片进行H&E染色。应用免疫组织化学染色法,检测PARP-1、MMP2、MMP9 及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表达水平。10.统计学分析运用SPSS v18.0软件进行数据分析。所有数据用均数±标准误（Mean±SEM）表示,采用One-way ANOVA和Tukey post-hoc方法进行分析,p值<0.05时视为有统计学意义。研究结果1.高糖刺激促使HASMCs中PARP-1的表达增加用高糖（33mM,HG）刺激HASMCs,Western Blot检测发现PARP-1蛋白表达量于72小时达高峰。2.高糖刺激通过上调PARP-1促进HASMCs增殖Cell-LightTM EdU检测结果发现,与NC组和OC组相比,HG刺激显著提高了HASMCs对EdU的摄取率;在HG环境下,加入PARP-1抑制剂PJ34则很大程度的减低了 EdU摄取率。流式细胞周期检测发现,与NC组和OC组相比,HG组G1期细胞数目明显减少而S期细胞数目明显增加;PJ34显著抑制了 HG诱导的G1-S期转换。Western Blot结果提示,相比于与NC组和OC组,HG组中PARP-1活性产物PAR和G1-S期转换的重要标志物PCNA表达均明显上升;PJ34可显著抑制HG诱导的PAR、PCNA表达的增加。以上说明HG刺激可通过上调PARP-1的表达和活性,促进细胞G1-S期转换,进而促进HASMCs增殖。3.高糖刺激通过上调PARP-1促进HASMCs迁移Transwell细胞迁移实验结果表明,与NC组和OC组相比,HG组HASMCs的迁移率显著提高;HG+PJ34组相比于HG组细胞迁移率明显降低。Western Blot和明胶酶谱检测结果显示,相比于NC组和OC组,HG组MMP2和MMP9表达和活性显著提高;在HG环境下,加入PJ34可显著抑制MMPs的表达和活性。4.PARP-1促进糖尿病小鼠血管内膜增生H&E染色结果显示,与正常对照组相比,糖尿病C57BL/6小鼠颈动脉内膜明显增厚;糖尿病PARP-1-/-小鼠颈动脉内膜厚度相比于糖尿病C57BL/6小鼠明显减小。免疫组化染色结果显示,与正常对照组相比,糖尿病C57BL/6小鼠颈动脉内膜明显增厚,其中PARP-1、PCNA、MMP2和MMP9的表达明显增加;相比于糖尿病C57BL/6小鼠,糖尿病PARP-1-/-小鼠颈动脉内膜中PCNA、MMP2和MMP9的表达明显减低。另外,我们用主动脉切片进行免疫组化染色,结果与颈动脉切片一致。5.PARP-1在人冠状动脉内膜增生中的作用与正常对照组相比,增生组内膜中PARP-1、PCNA、MMP2和MMP9的表达明显增加,与小鼠实验结果一致。研究结论1.在高糖刺激下的HASMCs和糖尿病血管中,PARP-1的表达上调。2.PARP-1通过促进细胞G1-S期转换,促进HASMCs增殖;通过上调MMP2、9的表达和活性,促进HASMCs迁移。3.糖尿病小鼠体内,PARP-1上调可促进VSMCs增殖、迁移及内膜增厚,敲除PARP-1可有效抑制血管内膜增生。研究背景越来越多的证据支持“代谢记忆”在糖尿病患者血管并发症中的作用。“代谢记忆”是指早期高糖环境引起的血管应激现象在血糖正常后可以持续存在,高糖似乎能够被血管、心脏、肾脏和眼睛等器官所“记忆”。目前研究认为表观遗传学可能是代谢记忆的潜在机制。表观遗传修饰在调节组织特异性基因表达中起着关键作用,其改变可能会导致基因功能和代谢的长期变化,这种变化会持续疾病的整个过程。表观遗传学机制,包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化等,它们共同激活多种信号转导途径,调节相关基因表达,涉及血管、心脏、肾脏和眼睛等器官,参与糖尿病动脉粥样硬化（AS）、糖尿病心肌病和微血管并发症的发生发展。根据沿基因组的分布,5-甲基胞嘧啶被认为是DNA的第五个碱基---它构成了表观遗传学中染色质修饰的一部分。甲基化的胞嘧啶分散在整个基因组中,而未甲基化的残基主要位于称为CpG岛的特定区域内。小鼠基因组中的37,000个CpG岛代表1-2%的DNA,并且通常位于管家基因的59个启动子区域中,与编码区域重叠到不同程度。通常情况下,CpG岛通常是未甲基化的,相关基因转录活跃;然而CpG岛的序列富含CpG二核苷酸,其是DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）的最佳底物,但当这些区域经历甲基化时,相关基因的转录受到抑制。近年来研究发现,PARP-1不仅能调节转录因子的表达和活性,还能影响表观遗传学修饰和染色质重塑,进而调控基因的表达。Schreiber等人发现,组蛋白的多聚ADP核糖化能致使DNA损伤位点染色质结构开放,这是PARP-1第一次被证实具有表观遗传调节功能。Lodhi等人表明,PARP-1在有丝分裂中可作为一种全基因组的表观遗传学标记物存在。他们报告称,PARP-1在有丝分裂中期染色体转录起始位点建立稳定的表观遗传标记,这些标记是有丝分裂后转录组重启的先决条件。PARP-1还能通过调控启动子的多聚ADP核糖化水平和组蛋白的乙酰化水平,影响线粒体DNA的修复和转录。此外有研究发现,PARP-1可以调节DNMT-1的表达和活性,进而影响DNA的甲基化模式。全基因组分析表明,抑制PARP-1的活性对不同功能基因和不同基因区段的DNA甲基化模式有不同影响,因而其对DNA甲基化的调控机制非常复杂。在前期研究中,我们已经证实PARP-1在高糖诱导的VSMCs增殖和迁移中的作用。下一步,我们将通过基因谱芯片技术筛选出PARP-1的下游分子,验证它在VSMCs增殖和迁移中的作用,并深入探讨PARP-1调节该分子的具体机制。研究目的1.筛选PARP-1抑制后显著差异表达且与细胞增殖和迁移相关的分子,并验证芯片结果;2.验证该下游分子在HASMCs增殖和迁移中的作用及机制;3.探索PARP-1调控该下游分子表达的具体机制。研究方法1.表达谱芯片分析HASMCs经高糖（HG,33 mM葡萄糖）、高糖+PARP-1抑制剂（HG+PJ34,33 mM葡萄糖+5μM PJ34）处理72小时后,提取总RNA,用于表达谱芯片检测。2.腺病毒转染细胞用腺病毒空载（OE-NC）、组织因子途径抑制物（TFPI）-2基因过表达腺病毒组（OE-TFPI-2）、干扰腺病毒对照（shRNA-NC）和TFPI-2基因干扰腺病毒（shRNA-TFPI-2）分别转染HASMCs。过夜培养后更换新鲜培养基,继续培养72小时,或加入高糖（30mM）或高渗溶液继续刺激细胞72小时。3.蛋白质印迹法（Western Blot）提取不同干预组HASMCs的蛋白,采用Western Blot方法检测TFPI-2、MMP2、MMP9及PCNA在蛋白水平的变化。采用Image J软件分析条带的平均密度值和面积,以β-actin为内参照蛋白。4.HASMCs增殖检测用Cell-LightTM EdU方法检测细胞的增殖情况。5.流式细胞术检测收集干预后的细胞,碘化丙啶（propidiumiodide,PI）染色,利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。6.HASMCs迁移检测用Transwell小室法检测细胞的迁移情况。7.明胶酶谱用明胶酶谱法检测各组HASMCs上清液中MMP2和MMP9的活性。8.DNA甲基化检测利用 NCBI（National Center for Biotechnology Information）网站查找 TFPI-2 启动子转录起始点上游5000 bp及下游1000 bp的序列;利用CpG岛在线预测网站http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/embosscpgplot/预测序列潜在的 CpG 岛。用Agena EpiDesigner程序对该序列进行引物方案设计。亚硫酸盐处理待检测DNA样品,进行Agena MassArray系统甲基化检测。9.实验动物模型构建实验动物对象为C57BL/6小鼠和C57BL/6/PARP-1基因敲除小鼠,均为8周龄、雄性、体重约25 g。将10只C57BL/6小鼠和10只C57BL/6/PARP-1-/-小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）,剂量为50mg/kg/d,另外10只C57BL/6小鼠腹腔注射等体积的柠檬酸盐缓冲液作为对照组,连续注射5天。2周后检测随机血糖值,大于16.7 mmol/l为1型糖尿病造模成功。最终实验动物分组如下:正常对照组、糖尿病C57BL/6小鼠组、糖尿病PARP-1-/-小鼠组。造模成功后,糖尿病和非糖尿病小鼠均行左侧颈总动脉结扎手术,术后3周取材。10.免疫组织化学染色将4%多甲醛固定后的小鼠左侧颈总动脉进行石蜡包埋,用石蜡切片机进行切片,固定厚度为5μm,切片做好编号。应用免疫组织化学染色法检测TFPI-2的表达水平,检测所用的一抗为兔来源TFPI-2抗体（1:40）,4℃孵育过夜。PBS清洗后,孵育兔二抗,DAB显色后,Harris苏木素溶液染核,进行程序性脱水后封片。11.统计学分析运用SPSS v18.0软件进行数据分析。所有数据用均数±标准误（Mean±SEM）表示,采用One-way ANOVA和Tukey post-hoc方法进行分析,p值<0.05时视为有统计学意义。研究结果1.筛选PARP-1作用的下游分子基因表达谱芯片结果显示,相对于HG组,HG+PJ34组中组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor,TFPI）-2的表达明显升高,后者可负向调节VSMCs的增殖和迁移。为了验证基因芯片结果,我们用Western Blot定量分析检测TFPI-2的蛋白表达量,与NC组相比,HG组TFPI-2表达明显减低;而HG+PJ34组相对于HG组其TFPI-2表达明显升高。颈动脉切片免疫组化染色结果显示,与正常对照组相比,糖尿病C57BL/6小鼠颈动脉内膜中TFPI-2表达水平明显降低;而相比于糖尿病C57BL/6小鼠,糖尿病PARP-1-/-小鼠血管内膜中TFPI-2的表达明显升高。2.TFPI-2在HASMCs增殖和迁移中的作用Cell-LightTM EdU检测结果表明,过表达TFPI-2可明显减低HASMCs的EdU摄取率;而沉默TFPI-2后EdU摄取率明显增加。Western Blot结果提示,过表达TFPI-2后HASMCs中PCNA表达水平明显减低;而沉默TFPI-2后PCNA表达水平明显增加。Transwell细胞迁移实验结果表明,过表达TFPI-2可明显减低HASMCs的迁移率;而沉默TFPI-2后细胞迁移率明显增加。Western Blot和明胶酶谱检测结果也发现,过表达TFPI-2可明显抑制MMP2和MMP9的表达和活性;而沉默TFPI-2后MMPs的表达和活性明显减低。3.TFPI-2在高糖诱导HASMCs增殖中的作用我们用OE-NC和OE-TFPI-2腺病毒转染HASMCs,再用高糖（HG）或高渗（OC）溶液继续刺激72小时。Cell-LightTM EdU检测结果发现,与OE-NC组相比,HG刺激提高了 HASMCs对EdU的摄取率;而在HG环境下,过表达TFPI-2显著降低了 EdU摄取率。流式细胞周期检测结果表明,过表达TFPI-2可显著抑制HG诱导的G1-S期转换。Western Blot定量分析结果提示,过表达TFPI-2可明显逆转HG诱导的PCNA表达的增加。4.TFPI-2在高糖诱导HASMCs迁移中的作用Transwell细胞迁移实验结果表明,与OE-NC组相比,HG刺激显著提高了HASMCs的迁移率;过表达TFPI-2可有效抑制HG诱导的细胞迁移。Western Blot和明胶酶谱检测结果提示,HG刺激下HASMCs中MMP2和MMP9表达和活性均有增加;而过表达TFPI-2可有效逆转HG的作用。5.PARP-1促使TFPI-2启动子区域CpG位点甲基化水平升高Sequenom MassArray质谱数据显示,与OC组相比,HG组TFPI-2启动子CpG3位点甲基化水平明显升高,而抑制PARP-1能明显减低CpG3、4位点的甲基化水平。6.TFPI-2基因的去甲基化促进其表达我们应用甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC刺激HASMCs,以探索HASMCs中TFPI-2甲基化水平能否影响其基因表达。Western Blot结果显示,与HG组相比,HG+5-Aza-dC组TFPI-2蛋白表达量明显升高,相应的,其下游因子PCNA、MMP2和MMP9表达明显减低。研究结论1.在高糖刺激的HASMCs和糖尿病血管内膜中,PARP-1上调可抑制TFPI-2的表达;2.TFPI-2可以抑制细胞G1-S期转换,下调MMP2、9的表达和活性,进而抑制高糖诱导的HASMCs增殖和迁移;3.PARP-1促使TFPI-2启动子区域CpG位点甲基化水平升高,这与TFPI-2的表达抑制有关。研究背景过氧化酶增殖因子活化受体gamma（PPARy）是一类核转录因子,在糖尿病和心血管疾病发生发展中起重要作用。PPARγ被配体激活后,在RXRα的辅助下与靶基因启动子上的过氧化物酶体增殖物反应元件（PPRE）结合,使靶基因活化和表达。在人类早期AS病变和大鼠动脉球囊损伤后形成的新生内膜中,PPARγ的表达上调,表明PPARγ可能在血管受损后的重构中发挥了重要的作用。研究发现,PPARγ激活剂能减弱有丝分裂原诱导的p27的降解,抑制cyclins/CDKs复合物的活性,导致细胞周期阻滞在G1期。此外,PPARy可通过抑制转录因子Ets-1的表达及随后MMPs的产生,抑制ECM降解和VSMCs迁移。在糖尿病患者的血清和大多数组织中,糖基化终末产物（AGEs）含量丰富,其形成是糖尿病心血管并发症发生发展的重要机制之一。AGEs的特异性受体（RAGE）广泛表达于VSMCs、血管内皮细胞、单核巨噬细胞及成纤维细胞等,AGEs可与RAGE相互作用产生一系列生物学效应。AGEs可以刺激VSMCs的增殖和迁移,加速AS和血管再狭窄的发生和发展。研究发现,PPARγ激动剂除了直接调控细胞周期进展和MMPs的表达,还可通过下调RAGEs的表达,抑制AGEs诱导的VSMCs增殖、迁移和内膜增生。论文Ⅱ部分证实,TFPI-2可以抑制细胞周期G1-S期转换和MMP2、9的表达及活性,然而其是间接抑制还是直接抑制尚不清楚。分泌到ECM的TFPI-2可以间接抑制血纤维蛋白溶酶和胰蛋白酶介导的MMPs的活化。核定位的TFPI-2可与转录因子AP-2α相互作用,负向调节MMP-2基因的转录和表达,进而抑制细胞迁移。另外有研究表明,TFPI-2可通过促进PPARγ的磷酸化来抑制MMP2和MMP9的表达,从而减少ECM的降解,延缓AS病变的发生并增加斑块稳定性。因而,PPARy激活可能是TFPI-2调节血管平滑肌细胞增殖和迁移的下游通路之一。人参皂苷作为人参的主要药理活性成分,有益于糖尿病和心血管疾病的治疗。结构上,人参皂苷包含一个疏水性的三萜骨架,其C3、C6、C20位点连接有亲水性的糖基或羟基,大多存在同型异构体,而人参皂苷同型异构体可能因其立体选择性而呈现不同生物学效应。人参皂苷Rg3被公认为是PPARγ的天然配体,因其有相邻两个羟基连接在手性中心C-20位点,故存在同型异构体20（R）-Rg3和20（S）-Rg3。研究发现,人参皂苷20（S）-Rg3对血管内皮细胞中PPARγ的激动作用要比20（R）-Rg3强10倍;Rg3同型异构体可通过不同程度的激活PPARγ,不同程度的诱导新生血管形成。介于合成型PPARy激动剂如罗格列酮可能增加心肌梗死的发生和心血管死亡率,研究天然的新型PPARγ激动剂对于治疗糖尿病血管内膜增生和AS斑块形成具有重大临床意义。本实验将进一步研究人参皂苷Rg3同型异构体对PPARγ的立体选择性;探索Rg3同型异构体是否可以通过对PPARy的不同程度激活作用,对AGEs诱导的VSMCs增殖、迁移及糖尿病AS斑块形成表现出不同的治疗效果。研究目的1.验证PPARγ是否为TFPI-2的下游靶分子;2.验证Rg3同型异构体对PPARγ的不同程度激活作用;3.比较Rg3同型异构体对AGEs诱导的VSMCs增殖和迁移的影响,并探索其分子机制;4.比较Rg3同型异构体对糖尿病动脉粥样硬化斑块形成的影响,并探索其分子机制。研究方法1.细胞培养及分组（1）用含2%FBS的SMCM培养基对人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）进行体外培养,具体分组为:分组一:腺病毒空载组（OE-NC）、组织因子途径抑制物（TFPI）-2基因过表达腺病毒组（OE-TFPI-2）;分组二:干扰腺病毒对照组（shRNA-NC）、TFPI-2基因干扰腺病毒组（shRNA-TFPI-2）;分组三:OE-NC 组、AGEs+OE-NC 组、AGEs+OE-TFPI-2 组;（2）体外培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞系（MOVAS细胞）和人源胚胎肾（HEK）293T细胞,用含10%FBS、5.5mM糖的DMEM培养基。具体分组为:分组一:正常对照组（Control 组）、20（R）-Rg3 10μmol/l组、20（R）-Rg3 25μmol/l组、20（R）-Rg3 50μmol/l组、20（S）-Rg3 10μmol/l 组、20（S）-Rg3 25μmol/l组、20（S）-Rg3 50μmol/l 组;分组二:Control 组、AGEs 组、AGEs+20（R）-Rg3 10μmol/l 组、AGEs+20（R）-Rg325μmol/l 组、AGEs+20（R）-Rg3 50μmol/l 组、AGEs+20（S）-Rg3 10μmol/l 组、AGEs+20（S）-Rg3 25μmol/l 组、AGEs+20（S）-Rg3 50μmol/l 组;分组三:Control组、AGEs 组、AGEs+20（R）-Rg3 组、AGEs+20（R）-Rg+GW9662组、AGEs+20（S）-Rg3、AGEs+20（S）-Rg3+GW9662 组。2.HEK293T细胞质粒转染及荧光素酶报告基因检测将构建好的报告质粒（PPRE）X3-TK-luc、表达质粒pSG5-PPARγ和表达质粒pSG5-RXRα共转染HEK293T细胞。转染6小时后更换新鲜培养基,加入AGEs及不同浓度20（R）-Rg3和20（S）-Rg3后继续培养24小时,检测荧光素酶活性。3.MOVAS细胞增殖检测用CCK-8及Cell-LightTMEdU方法检测经干预后细胞的增殖情况。4.流式细胞术检测收集干预后的细胞,碘化丙啶（propidiumiodide,PI）染色,利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。5.MOVAS细胞迁移检测用Transwell小室法检测干预后细胞的迁移情况。6.明胶酶谱检测用明胶酶谱法检测各组MOVAS细胞上清液中MMP2、9的活性。7.实验动物模型的建立和分组将雄性ApoE-/-小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）-柠檬酸缓冲液,对照组小鼠仅注射等体积柠檬酸缓冲液,剂量为50mg/kg/天,连续5天。2周后检测随机血糖值,大于16.7 mmol/l为1型糖尿病造模成功。将小鼠分为6组:正常对照组（Control 组）、单纯糖尿病组（DM 组）、DM+20（R）-Rg3 组、DM+20（R）-Rg3+GW9662 组、DM+20（S）-Rg3 组、DM+20（S）-Rg3+GW9662 组。普食喂养6周后给予药物干预,Rg3采用腹腔注射方式给药（10mg/kg,隔天1次）,Control组和DM组仅注射等体积生理盐水;GW9662采用灌胃的方式给药（3mg/kg/天）,其他组仅给予等体积PBS。小鼠于给药4周后检测各组小鼠随机血糖水平,然后将小鼠安乐死,留取心脏组织及血液并适当保存。8.血脂谱检测取材前心脏取血,离心取上清液,样品送入医院检验科,分别测量甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平。9.组织标本病理学检测对主动脉行大体油红O染色以评估斑块负荷。主动脉根部连续切片分别行苏木素-伊红（H&E）染色、免疫荧光双染及免疫组织化学染色,分别测量主动脉根部斑块横断面面积、斑块内处于增殖状态的平滑肌细胞（PCNA/α-SMA）数目和MMP2、9的含量百分比。10.蛋白质印迹法（Western Blot）提取小鼠主动脉组织及不同干预组细胞的蛋白,采用Western Blot方法检测cyclinD1、cyclinE、PCNA、MMP2 及 MMP9 在蛋白水平的变化,以 β-actin 或GAPDH为内参照蛋白。11.统计学分析运用SPSS v18.0软件进行数据分析。所有数据用均数±标准误（Mean±SEM）表示,采用One-way ANOVA和Tukey post-hoc方法进行分析,p值<0.05时视为有统计学意义。研究结果1.AGEs刺激下TFPI-2表达下调可以抑制PPARγ的表达Western Blot结果显示,与OE-NC组相比,OE-TFPI-2组PPARγ表达明显升高;而相比于shRNA-NC组,shRNA-TFPI-2组PPARγ表达明显减低。在AGEs刺激MOVAS细胞中,TFPI-2和PPARy表达明显下降;而过表达TFPI-2可有效逆转AGEs诱导的PPARγ表达的变化。因而,TFPI-2可以正向调控PPARγ的表达,结合先前多个研究已证实PPARγ是调节VSMCs增殖和迁移的重要核转录分子,我们认为PPARγ可能是TFPI-2调节VSMCs增殖和迁移的下游靶点之一。2.Rg3同型异构体对PPARγ的激活作用荧光素酶报告基因检测结果显示,Rg3同型异构体对PPARγ的激活作用均呈浓度依赖性（10、25、50μmol/l）,且20（S）-Rg3的作用比20（R）-Rg3强。3.Rg3同型异构体对AGEs诱导的MOVAS细胞增殖的影响CCK8 检测结果显示,20（R）-Rg3（10、25、50μmol/l）和 20（S）-Rg3（10、25、50μmol/l）对MOVAS细胞均无细胞毒性;Rg3同型异构体呈浓度依赖性的抑制AGEs诱导的MOVAS细胞增殖,其中25μmol/l和50μmol/l 20（S）-Rg3的抑制作用相对于同浓度的20（R）-Rg3有统计学意义,因此我们选择25μmol/l Rg3进行以下实验。Cell-LightTM EdU检测进一步证实,Rg3同型异构体均可通过激活PPARγ抑制EdU摄取率,而20（S）-Rg3的作用更强。4.Rg3同型异构体对AGEs诱导的MOVAS细胞周期进展的影响流式细胞周期检测结果显示,与AGEs组比较,20（R）-Rg3+AGEs组和20（S）-Rg3+AGEs组的G1期细胞数目升高而S期细胞数目明显减低。Western Blot结果显示,Rg3同型异构体均能有效的抑制细胞周期蛋白cyclinD1、cyclinE和PCNA的表达。上述结果中,20（S）-Rg3比20（R）-Rg3的作用更强,而抑制PPARγ可很大程度的抵消Rg3的作用。5.Rg3同型异构体对AGEs诱导的MOVAS细胞迁移的影响Transwell实验结果显示,和AGEs组比较,20（R）-Rg3和20（S）-Rg3均可降低细胞迁移率。Western Blot和明胶酶谱检测发现,Rg3同型异构体均能有效抑制MMP2和MMP9的表达和活性。上述结果中,20（S）-Rg3比20（R）-Rg3的作用更强,且抑制PPARγ可很大程度的抵消Rg3的作用。6.实验小鼠的基本情况及指标实验末,DM+20（S）-Rg3组小鼠血糖水平较DM组明显减低;各组小鼠的血脂水平无统计学差异。7.Rg3同型异构体对糖尿病小鼠体内AS斑块负荷和面积的影响大体油红O染色结果显示,与DM组相比,注射Rg3同型异构体可有效降低斑块负荷。H&E染色发现,Rg3干预组的斑块横断面面积较DM组均显著减小。上述结果中,20（S）-Rg3的作用比20（R）-Rg3强,而PPARγ抑制剂干预可以很大程度的抵消其作用。8.Rg3同型异构体对糖尿病小鼠体内VSMCs增殖和迁移的影响荧光双染结果显示,20（R）-Rg3+DM组和20（S）-Rg3+DM组小鼠AS斑块内PCNA+αSMA+双阳性细胞数目较DM组明显减少,提示处于增殖状态的VSMCs数目减少。免疫组化染色结果表明,Rg3干预组小鼠AS斑块内MMP2和MMP9表达量较DM组明显减低。Western Blot结果显示,与DM组相比,,Rg3干预组中cyclinD1、cyclinE、PCNA、MMP2及MMP9的表达水平均明显减低。Western Blot 结果显示,与 DM 组相比,,Rg3 干预组中 cyclinD1、cyclinE、PCNA、MMP2及MMP9的表达水平均明显减低。上述结果中20（S）-Rg3比20（R）-Rg3的作用更强,而抑制PPARγ可很大程度的抵消其作用。研究结论1.PPARγ是TFPI-2的下游靶分子;2.Rg3同型异构体均可激活PPARγ,其中20（S）-Rg3的激活作用更强;3.Rg3同型异构体均可通过激活PPARγ,抑制细胞G1-S期转换和MMP2、9的表达和活性,进而抑制AGEs诱导的VSMCs增殖和迁移,其中20（S）-Rg3的作用更强;4.Rg3同型异构体均可通过激活PPARγ抑制糖尿病AS斑块形成,其中20（S）-Rg3的作用更强。