背景和目的矽肺目前仍是发病率较高、进展较快、病情最严重的职业病。以往研究认为,在矽尘的持续作用下,肺成纤维细胞被细胞因子、机械因素及细胞外基质等激活,转分化为肌成纤维细胞进而合成分泌胶原蛋白,是矽肺发病的重要环节。近年来研究发现,外泌体及其内容物、特别是miRNAs,作为一种新型的细胞间信号传递介质,在血管生成、抗原呈递、细胞内稳态失衡、炎症等多种生物学过程中发挥重要作用,参与调控癌症、纤维化等多种疾病发生发展过程。本课题组前期通过miRNA高通量测序,发现矽肺患者血清中外泌体miRNA谱发生明显改变。但是,目前对外泌体miRNAs在矽肺发生发展中的实际存在水平、分布规律,及其是否有效介导信号传递尚不清楚。因此,开展矽肺患者血清学调查和矽肺小鼠模型的实验研究,观察外泌体miRNAs含量水平、分布特征和生物学作用;建立体外细胞实验模型,探讨巨噬细胞外泌体中miRNA对肺成纤维细胞转分化中的介导效应、可能的靶点与信号传导通路,进一步揭示其确切调控机制,为拓展对矽肺发病机制的阐释提供新的思路,也为进一步研发潜在的矽肺生物标志和干预靶点提供参考依据。方法1.矽肺患者血清外泌体miRNAs检测及靶基因预测1.1研究对象以矽肺患者50例为病例组,无接尘史健康者50例为对照组。收集研究对象基线资料,采集静脉外周血、分离血清。1.2血清外泌体提取方法筛选分别采用超速离心法、30%蔗糖垫法、8%PEG+wash法、8%PEG+5%PEG法及试剂盒法提取血清外泌体,通过透射电子显微镜观察、纳米颗粒追踪分析、Western blot检测三种方法对外泌体进行鉴定,并比较外泌体的得率及纯度,确定最适方法。1.3矽肺患者血清外泌体miRNAs水平检测提取研究对象血清中外泌体miRNA,RT-qPCR检测miR-27b-5p、miR-30c-2-3p、miR-107、miR-122-5p、miR-125a-5p、miR-126-5p、miR-335-5p 的水平。1.4 miRNAs靶基因预测利用miRWalk网站对检测出的差异miRNAs进行靶基因预测和筛选。2.矽肺小鼠中外泌体miR-107水平时序分布规律及其作用观察2.1矽肺小鼠模型建立将50只C57BL/6N小鼠随机分为SiO2组和对照组,每组25只。采用非暴露式SiO2粉尘气管滴注法建立矽肺小鼠模型,染尘后1、7、14、28、56天分批处死小鼠,每次每组5只,收集外周血及肺组织。HE、Masson染色观察小鼠肺脏病理改变,Western blot检测纤维化标志α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin及CDK6表达以鉴定模型建立情况。2.2矽肺小鼠血清外泌体、肺组织中miR-107水平检测RT-qPCR检测小鼠血清外泌体、肺组织中miR-107水平以观察其在矽肺发生发展中的分布特点,并分析两者相关性。2.3矽肺小鼠发病中miR-107的干预效应观察人工合成miR-107抑制剂antagomir进行干预观察。20只小鼠随机分为SiO2+anta-miR组、SiO2+anta-NC组、SiO2组及对照组,每组5只,于染尘后28天处死,观察其肺脏病理改变,检测肺组织中miR-107水平及相关蛋白表达水平,原位杂交与免疫荧光共染观察miR-107及Collagen Ⅰ水平。3.染尘巨噬细胞外泌体中miR-107对肺成纤维细胞转分化的激活作用及其机制研究3.1染尘巨噬细胞来源外泌体的提取和鉴定以SiO2粉尘刺激小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),设立对照组,分别提取其外泌体并鉴定。3.2染尘巨噬细胞外泌体及其所含miR-107对肺成纤维细胞转分化的激活作用观察RAW264.7细胞培养稳定后,提取其外泌体与小鼠胚肺成纤维细胞(NIH-3T3)共孵育,激光共聚焦显微镜观察NIH-3T3细胞摄取外泌体情况,检测RAW264.7细胞及其外泌体与NIH-3T3细胞中miR-107水平。检测NIH-3T3细胞转分化标志 α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin 及 CDK6 蛋白表达水平。将miR-107人工合成模拟物(mimic)及其阴性对照(negativecontrol,NC)分别转染RAW264.7细胞,分离外泌体、检测其miR-107水平。将外泌体分别作用于NIH-3T3细胞,检测其转分化相关标志及CDK6蛋白表达水平。3.3 miR-107 在转化生长因子 β(transforming growth factor,TGF-β)诱导的肺成纤维细胞转分化中的激活作用机制研究双荧光素酶基因报告验证miR-107～CDK6靶关系:将CDK6-3’UTR野生型和突变型质粒分别转染至293T细胞中,比较不同水平miR-107所致报告基因表达的改变,判断miR-107对CDK6是否具有抑制作用,以验证其靶向关系。系列浓度TGF-β刺激NIH-3T3细胞,检测细胞中miR-107和CDK6基因水平。采用 miR-107 mimic 及其抑制剂(inhibitor)、CDK6 小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)、过表达CDK6质粒分别转染NIH-3T3细胞并检测转分化相关标志、CDK6及信号通路蛋白cyclinD、pRb、Rb、E2F1表达,流式细胞术检测其细胞周期。采用 miR-107 mimic、mimic-NC、miR-107 inhibitor、inhibitor-NC 分别转染人胚肺成纤维细胞(MRC-5),检测细胞转分化相关标志及CDK6蛋白表达水平。4.统计学分析采用SPSS21.0统计软件进行数据统计分析。计量资料以K-W检验正态性,服从正态分布的数据以x±s表示,两组间样本差异比较采用两独立样本均数t检验,多组间样本差异采用ANOVA;不服从正态分布的数据以中位数和上下四分位数表示,样本差异比较采用秩和检验,检验水准α=0.05。结果1.矽肺患者血清外泌体miRNAs检测与靶基因预测结果1.1血清外泌体提取方法筛选结果超速离心法外泌体得率及纯度均较低,30%蔗糖垫法纯度高但得率低,试剂盒法外泌体得率高但纯度低,相较于8%PEG+wash法,8%PEG+5%PEG法外泌体纯度稍低但得率更占优势。确定8%PEG+5%PEG法为最适提取方法。1.2矽肺患者血清外泌体miRNAs水平检测结果对照组与病例组平均年龄、不同期别矽肺患者平均年龄和工龄差异均无统计学意义。与对照组相比,病例组 miR-107、miR-122-5p、miR-125a-5p、miR-126-5p、miR-335-5p水平均升高。进一步分析发现,与壹期矽肺患者相比,贰期患者5条miRNAs水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。1.3 miRNAs靶基因的预测结果miRWalk网站预测发现5对miRNAs～靶基因交互作用模式:miR-107～CDK6、miR-122-5p～TFDP2、miR-125a-5p～TRAF6、miR-125a-5p～CBX7、miR-125a-5p～VSIR,其中以miR-107～CDK6评分最高。2.矽肺小鼠中外泌体miR-107水平时序分布规律及其作用观察结果2.1矽肺小鼠模型建立结果病理检查结果发现,染尘小鼠肺组织前14天以炎症反应为主,之后以纤维化病变为主。2.2矽肺小鼠血清外泌体、肺组织中miR-107水平检测结果与对照组相比,SiO2组小鼠血清外泌体miR-107水平于第7天降低,第14、28、56天升高;肺组织miR-107水平于染尘后第7天降低,第28、56天升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。血清外泌体miR-107水平与肺组织miR-107水平呈正相关。2.3矽肺小鼠发病中miR-107的干预效应观察结果与SiO2+anta-NC相比,SiO2+anta-miR组的肺组织未出现大块的细胞结节,胶原累积较少,miR-107水平降低,纤维化相关标志蛋白表达降低,CDK6表达升高。3.染尘巨噬细胞外泌体中miR-107对肺成纤维细胞转分化的激活作用及其机制研究结果3.1染尘巨噬细胞来源外泌体的鉴定结果透射电子显微镜下可见巨噬细胞外泌体为直径30-150 nm的茶托样脂质双分子层结构。与对照组相比,SiO2组外泌体标志相关蛋白表达升高,颗粒浓度升高,差异具有统计学意义(P<0.05),颗粒粒径无明显变化(P>0.05)。3.2染尘巨噬细胞外泌体及其所含miR-107对肺成纤维细胞转分化的激活作用观察结果激光共聚焦显微镜观察SiO2粉尘诱导的巨噬细胞外泌体及对照组外泌体分别孵育的NIH-3T3细胞均为红色梭形,点状绿色的外泌体聚集在细胞周围或与细胞膜融合(呈黄色),两组绿色荧光分布及数量无明显差异。与对照组相比,SiO2粉尘刺激的RAW264.7细胞及其外泌体、NIH-3T3细胞中miR-107水平均明显升高(P<0.05)。SiO2粉尘刺激的巨噬细胞外泌体孵育的NIH-3T3细胞相对于未染尘巨噬细胞孵育和单纯NIH-3T3细胞,转分化标志相关蛋白表达明显升高,CDK6表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染miR-107 mimic后RAW264.7细胞外泌体中miR-107水平升高,以其刺激NIH-3T3细胞后,细胞转分化相关标志蛋白表达水平升高、CDK6表达水平降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.3 miR-107在TGF-β诱导的肺成纤维细胞转分化中的激活作用机制实验结果双荧光素酶基因报告结果显示,转染CDK6-3’UTR野生型质粒的细胞中,miR-107 mimic组的荧光素酶活性水平与mimic-NC组相比表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05);转染CDK6-3’UTR突变型质粒的细胞中,miR-107 mimic组与mimic-NC组的荧光素酶活性水平差异无统计学意义(P>0.05)。TGF-β刺激后NIH-3T3细胞miR-107水平升高,CDK6水平降低,其中2 ng/mL差异最大,因此以该浓度进行后续研究。与mimic-NC组相比,mimic组miR-107水平升高,CDK6水平降低,转分化相关标志水平升高;与inhibitor-NC组相比,inhibitor组miR-107水平下降,CDK6水平升高,转分化相关标志水平降低,G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高,CDK6下游的cyclin D、pRb、E2F1表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染CDK6质粒可明显升高细胞中CDK6表达,下调转分化相关标志蛋白表达;转染CDK6siRNA可明显沉默CDK6,上调转分化相关标志蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。与mimic-NC组相比,mimic-miR组MRC-5细胞转分化相关标志蛋白表达升高,CDK6表达降低;反之,与inhibitor-NC组相比,inhibitor-miR组MRC-5细胞转分化相关标志蛋白表达降低,CDK6表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论矽肺发病过程炎症期之后组织及血清外泌体miR-107水平增高,抑制miR-107可明显减轻肺纤维化。SiO粉尘诱导的巨噬细胞外泌体miR-107可促进肺成纤维细胞转分化,其机制可能是通过靶向抑制CDK6而激活细胞分化。