双子叶植物的表皮扁平细胞是构成叶表皮的主要细胞类型,是研究植物细胞分化、细胞极性、细胞命运决定、器官发生和形态建成的理想模型,对研究植物的发育机制具有重要意义。本论文从EMS诱变的拟南芥突变体库中筛选到一个表皮细胞形态异常的突变体,其叶表皮扁平细胞变大、叶肉细胞变大,下胚轴和根表皮细胞“肿胀”,因此我们将这个突变体命名为ecs1(epidermalcell swelling)。尤其重要的是ecs1在黑暗条件下表现出典型的乙烯组成型突变体具有的三重反应。遗传分析表明ecs1是一个由显性单基因控制的功能获得性突变体。我们利用图位克隆方法对ecs1突变基因进行定位,克隆到一个与植物抗病性相关的ECS1基因。通过基因功能分析和鉴定,初步确定ECS1通过增加核内复制调控拟南芥叶片表皮细胞的扩展,同时可能通过负调控ACS的稳定性参与乙烯的合成。1、利用牙齿树脂合成印迹方法观察ecs1叶表皮细胞,发现其扁平细胞变大;组织切片发现ecs1栅栏组织和海绵组织细胞也显著变大;同时,叶绿体类囊体基粒片层增多。暗培养下的ecs1黄化苗表现出典型的乙烯三重反应:即顶端弯钩加剧,下胚轴径向肿胀,下胚轴和主根变短,根毛过分增殖。突变体根表皮细胞变短、变宽,导致ecs1主根变短。除此之外,突变体莲座叶叶片变绿,叶绿素含量增加;表皮毛数目增加,分枝末端弯曲;长角果不对称着生,果荚长度减小。ecs1杂合体具有与纯合体相似的表型特征,但表型缺陷没有纯合体剧烈。2、流式细胞术分析发现ecs1突变体叶组织细胞核倍性水平升高;荧光原位杂交技术(FISH)以45SrDNA重复序列作为特异性探针,检测突变体叶组织细胞核,发现其核内复制水平明显增强,高倍性的细胞核(8C以上)在突变体叶组织中所占比率显著增加,表明其表皮扁平细胞和叶肉细胞变大与核内复制增强相关;通过DAPI染色标记,观察到突变体叶表皮扁平细胞核普遍增大;CYCB1,1-GUS标记发现ecs1中有丝分裂活性降低,进一步证明其核内复制水平增强。3、气相色谱仪检测发现,ecs1中内源乙烯释放量是野生型的2倍左右;添加乙烯抑制剂AVG和AgN03处理突变体,发现其可以部分恢复ecs1的表型,表明ecs1可能是一个新的乙烯组成型突变体;施加外源乙烯合成前体ACC,发现ecs1突变体的下胚轴、根长及根毛对ACC的敏感性反应减小。4、采用图位克隆设计SSLP和In/Del分子标记,将ecs1的突变基因定位在5号染色体上臂一段123Kb的区间内,对这一区间69个候选基因进行了测序,发现ECS1基因序列中第278位的C被T代替,引起ECS1蛋白高度保守的TIR结构域中的丝氨酸被苯丙氨酸替换,确定ECS1可能是导致突变体表皮细胞形态异常和出现乙烯三重反应的基因。5、构建35S启动子作用下ECS1基因融合GFP报告基因,以及ECS1自身启动子融合GUS基因的表达载体转化野生型植株。发现ECS1在拟南芥器官中普遍表达,在根和花中表达比较强烈;该蛋白主要定位在表皮细胞膜上和叶绿体中。鉴于ecs1杂合体具有纯合体的部分表型,为了验证ecs1是否为功能获得性突变体,我们构建了 35S启动子作用下ecs1融合GFP报告基因的表达载体并转化野生型。正常ECS1和突变的ecs1基因超表达的T2代植株表型分析发现,ECS1OX和ecs1OX的转基因植株能够模拟ecs1突变体叶表皮扁平细胞和叶肉细胞变大的表型,但是缺少乙烯三重反应,ECS1OX植株内源乙烯释放量降低。6、用Real-time qRT-PCR分析ecs1中调控细胞周期的关键基因表达水平,发现促进细胞周期的基因CYCB1、RBR、CDC2B、CYCD3表达量下调,而促进核内复制的基因KRP1、KRP2、E2FC的表达量显著上调,表明ecs1核内复制水平增强。发现ACS2和ACS6转录水平显著上升,可能是引起突变体中乙烯过量合成的原因;而受乙烯诱导的基因如CCHIB、ERF1、PDF1.2、EBP表达量普遍上调,进一步证实了ecs 突变体中乙烯合成过量。