论文部分内容阅读
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要的名优水产养殖品种。近来年随着养殖规模的不断扩大和养殖环境的日趋恶化,由细菌、病毒、寄生虫、类立克次体等病原生物等引起的病害日趋严重,给中华绒鳌蟹养殖业造成了巨大的损失,严重威胁、制约着我国蟹类养殖的健康发展。甲壳动物没有类似高等动物的特异性免疫系统,主要是依靠血细胞的天然免疫系统来防御病原微生物。对中华绒螯蟹先天免疫及相关机制研究已成为其抗病研究的热点,通过研究其免疫机制,可为进一步研发免疫相关制剂,调控免疫能力,以达到减少或清除病害、实现健康养殖的目的提供依据。本研究中,我们在确定了中华绒螯蟹血细胞类型的基础上,研究了各类细胞的体内吞噬功能、LPS诱导血细胞凋亡的机制、细胞粘附因子EsPX和丝裂原蛋白活化激酶EsMAPK等免疫相关蛋白在吞噬和凋亡中的免疫应答反应等。具体研究结果如下：1、中华绒螯蟹血细胞类型及吞噬功能结合相差显微镜、透射电子显微镜及细胞染色技术,本研究将中华绒螯蟹血细胞分为透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞三大类群。透明细胞为圆形、卵圆形或不规则形状,细胞质中含有极少数颗粒；半颗粒细胞为纺锤形或卵圆形,含有大量的小颗粒和少量具有折光性的大颗粒；颗粒细胞多为圆形、纺锤形或卵圆形,细胞质中含有大量的折光性大颗粒。透明细胞在血细胞中所占比例最大,在雌蟹和雄蟹分别为55.0%和59.8%,而半颗粒细胞和颗粒细胞在雌、雄蟹中所占比例分别为24.9%、20.1%和21.1%、19.2%；透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞对外源荧光微球均有一定的吞噬能力,其中透明细胞吞噬作用最明显,占吞噬细胞总数的88.7%,是行使吞噬功能的主要细胞类群,而半颗粒细胞和颗粒细胞分别只有5.0%和6.3%；三类血细胞均能吞噬大量荧光微球,吞噬指数分别为6.0,5.7和5.9。2、LPS对中华绒螯蟹血细胞凋亡的影响本实验结合透射电子显微镜、DNA片段化、流式细胞术和激光共聚焦等技术研究了LPS对中华绒螯蟹血细胞凋亡的影响。注射嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌和LPS均可诱导中华绒螯蟹血细胞数量急剧下降,随后又开始缓慢回升,其中嗜水气单胞菌和高浓度LPS组中华绒螯蟹血细胞下降幅度较大且恢复速度较慢。体外培养中华绒螯蟹血细胞,LPS刺激后发现细胞发生明显凋亡,凋亡细胞比例与LPS浓度之间呈正相关,且大多数凋亡细胞处于凋亡晚期；活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)检测结果显示半颗粒细胞和颗粒细胞内含有较强的活性氧信号,LPS刺激后细胞内ROS信号显著增强,随后又迅速减弱,因此推测LPS诱导的血细胞凋亡是因ROS过量表达引起的。3、中华绒螯蟹细胞粘附因子EsPX在细胞吞噬中的免疫反应经对中华绒螯蟹细胞粘附因子EsPX基因的结构及同源性分析,发现该基因编码框为2325bp,编码蛋白含有775个氨基酸,包括一个16个氨基酸大小的信号肽,预测的蛋白分子量和等电点分别为85.2 kDa和6.91,具有典型的KGD(Lys-Gly-Asp)结构域和酚氧化酶结构域。RT-PCR和荧光定量实时PCR检测结果显示EsPX基因在血细胞、性腺、肝胰腺、鳃、肌肉、心脏、肠道和胃中均有表达,在血细胞、肌肉和胃中的表达量较高；在受到聚苯乙烯荧光微球、LPS和嗜水气单胞菌刺激后,EsPX mRNA表达量均出现一个先上升后下降的趋势,而且在刺激后32 h基本都能恢复到初始水平。Western blotting和免疫荧光技术检测结果显示EsPX蛋白在透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞中均有分布,但在细胞质中表达量高于细胞核；体外培养中华绒螯蟹血细胞,经LPS刺激后,细胞内EsPX蛋白表达量显著上生并被释放到细胞外,期间伴随明显的细胞脱颗粒反应；添加聚苯乙烯微球后,血细胞能将接触到的荧光微球吞入细胞内,同时细胞内EsPX蛋白表达量显著上升并被释放到细胞外,推测该蛋白在血细胞吞噬荧光微球过程中起粘附辅助作用。4、中华绒螯蟹丝裂原蛋白活化激酶EsMAPK在细胞凋亡中的免疫反应经结构及同源性分析,发现中华绒螯蟹丝裂原蛋白活化激酶EsMAPK基因全长2455 bp,编码的蛋白含365个氨基酸,无信号肽序列,蛋白分子量和等电点分别为42.4 kDa和5.93,具有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶结构域；与其他甲壳动物同源性较高,均在95%以上。RT-PCR和荧光定量实时PCR检测结果显示EsMAPK基因在血细胞、性腺、肝胰腺、鳃、肌肉、心脏、肠道和胃中均有表达,其在肝胰腺中表达量最高,是血细胞的9.08倍；其次是肌肉和性腺。在受到LPS和嗜水气单胞菌刺激后,EsMAPK基因表达量分别出现显著的上调和下调。Western blotting及免疫荧光检测结果显示EsMAPK蛋白在透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞中均有表达,且主要分布在细胞质中；在受到LPS和嗜水气单胞菌刺激后,细胞内EsMAPK蛋白表达量显著升高,伴随有明显的脱颗粒反应和黑化作用,但蛋白未被释放到细胞外。