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目的本研究通过对多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵泡液外泌体进行高通量测序,验证外泌体内是否含有参与正常卵泡发育和PCOS患者异常卵泡发育的长链非编码RNA(longnoncoding RNA,lncRNA),并探究差异表达lncRNA的分子功能及在细胞中的代谢途径和功能的信号通路,为它们用作生物标志物或潜在的治疗方法奠定基础。方法选择2018年01月至2018年12月,于江苏省扬州市苏北人民医院的生殖中心就诊,并接受体外受精/卵泡浆内单精子注射-胚胎移植(in vitro fertilization/intrafollicular sperm injection-embryo transfer,IVF/ICSI-ET)助孕的不孕患者,28例多囊卵巢综合征患者(PCOS组)和28例因输卵管因素导致不孕的患者(对照组),共有56名受试者被纳入本研究。对纳入两组患者的基本内分泌激素、BMI及窦卵泡数等基本临床资料进行比较,利用超速离心法提取卵泡液外泌体,透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察其大小及形态,纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)以及免疫印迹试验(Western Blot,WB)鉴定分离获得的外泌体。挑选6名患者(3名PCOS和3名对照)样本进行测序建库,然后进行聚类分析,GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)用以阐述差异基因可能的功能意义。挑选6个差异表达的lncRNA通过RT-qPCR验证测序的结果的准确性。在GeneMANIA网站(http://genemania.org)上构建挑选的差异表达的lncRNA之间相互作用的表达谱。结果1.两组患者的临床参数分析结果表明,两组患者的年龄,孕酮(P),雌激素(E2),卵泡刺激素(FSH),获卵数,可移植胚胎数,空腹血糖,催乳素(PRL)均无统计学差异(P>0.05)。然而,黄体生成激素(LH),体重指数(BMI)和窦卵泡数目存在显着差异(P<0.05)。2.成功分离与鉴定人卵泡液来源的外泌体,透射电镜下观察外泌体的形态是具有双层膜结构的直径在30-150nm的盘状囊泡。同时使用纳米颗粒跟踪系统(NTA)测量纯化的细胞外颗粒的浓度和大小分布情况,结果显示颗粒的浓度为4.9×106个/mL,峰直径为127 nm。外泌体表面标志分子的蛋白质印迹结果显示,所获得细胞外颗粒均表达外泌体特异性标记分子CD9,进一步表明本研究中所获的细胞外囊泡是外泌体。3.RNA完整性质检合格。使用Norgen试剂盒提取RNA后,利用NanoDrop ND-2000(ThermoScientific)进行定量,结果与已报道的外泌体RNA研究结果一致,外泌体RNA的A260/280比值在1.1-1.6之间。进一步经过Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测 RNA 完整性(RNA integrity number,RIN 值),RNA 质检图可见明显的RNA峰,结果表明本项研究外泌体RNA质检合格,符合进一步建库测序的要求。4.PCOS组患者卵泡液外泌体中lncRNA与对照组患者的lncRNA进行比较,火山图显示差异表达的lncRNA,1 253个上调基因,613个下调基因。5.GO和KEGG和聚类分析,GO分析lncRNAs主要包含三大方面:组织细胞成分,生物过程和分子功能。细胞组分方面主要富集于细胞内(intracellular);生物过程主要集中于细胞成分组织或生物发生(cellular component organization or biogenesis),细胞成分组织(cellular component organization),分子功能方面主要富集于如黏附(binding)、蛋白质结合(protein binding)等。KEGG结果显示:差异lncRNA在卵母细胞减数分裂(oocyte meiosis)、胰岛素信号通路(insulin signaling pathway)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、胰岛素分泌(insulin secretion)、Ⅰ 型糖尿病(type Ⅰ diabetes mellitus)、Ⅱ型糖尿病(type Ⅱ diabetes mellitus)、雌激素信号(estrogen signaling pathway)等通路富集。6.RT-qPCR结果与测序结果一致,表明测序结果准确可靠。挑选了 6个lncRNA进行验证,其中多囊卵巢综合征组外泌体内DNMT1,DNMT2,DNMT3A和H19的表达水平与对照组相比显著降低,而SGK1表达与对照组相比显著增加,均有统计学意义(P<0.05)。7.对挑选差异表达的lncRNA作基因互作图,提示差异基因间密切相关并相互作用,特别是在DNA甲基化和基因共表达方面。结论1、本研究通过基因测序确定了 PCOS患者卵泡液外泌体全基因组lncRNA表达模式,并且与对照组比较分析了差异表达的lncRNAs,推测这些差异lncRNAs可能参与PCOS发生发展。2、DNMT1,DNMT2,DNMT3a,H19和SGK1可能参与DNA甲基化、表观遗传学,影响PCOS患者的家族遗传性,在PCOS发病中发挥重要作用。